Визуализация черепно-лицевого развития в Sox10: Kaede Трансгенные данио рерио Линия Использование Покадровый конфокальной микроскопии
Summary
Визуализация экспериментальных данных стала ключевым элементом в представлении результатов для научного сообщества. Генерация живой покадровой записи растущих эмбрионов способствует лучшей презентации и понимания сложных процессов развития. Этот протокол является шаг за шагом руководство по маркировке элементов через фотопреобразования Kaede белка у рыбок данио.
Abstract
Позвоночных палатогенезе является весьма Choreographed и сложный процесс развития, который включает в себя миграцию черепной нервного гребня (ЧПУ) клеток, конвергенции и расширения лицевых протуберанцев, и созревание черепно-лицевой скелет. Для изучения вклада черепной нервного гребня в конкретных регионах данио неба SOX10: Kaede трансгенных данио линия была сгенерирована. Sox10 предоставляет клонов ограничение Kaede репортера белка нервного гребня, тем самым делая клетку маркировка более точное процесс, чем традиционные краски или репортера инъекции мРНК. Kaede является фото-кабриолет белок, который меняет цвет с зеленого на красный после активации фото и дает возможность следить клетки точно. В Sox10: Kaede трансгенной линии была использована для выполнения анализа клонов очертить клеточные популяции с ЧПУ, которые приводят к верхнечелюстной против нижней челюсти элементов и иллюстрирующие гомологии лица протуберанцев в амниот. Этот протокол описывает шагс генерировать живой покадровой видео в Sox10: Kaede данио эмбрионов. Развитие решетчатой пластине будет служить в качестве практического примера. Этот протокол может быть применен, чтобы сделать покадровой конфокальной запись любого Kaede или аналогичного photoconvertible репортерного белка в трансгенных данио рерио. Кроме того, он может быть использован для захвата не только нормальным, но также аномалии развития черепно-лицевых структур в данио мутантов.
Introduction
Орофациальные расщелины представляют собой наиболее распространенную черепно-лицевой деформации, с 1/700-1, 000 поставки затронуты 1. Срыв начале эмбрионального черепно-лицевого развития может привести к образованию расщелиной губы и неба (CL / P). В то время как причины синдромному щели были в значительной степени показано, генетические и эпигенетические основы несиндромальных форм орофациального clefting все еще должны быть обнаружены 2-4. Для того, чтобы понять этиологию и патогенез этих пороков, необходимо осветить развитие черепно-лицевых структур на сотовой основе.
Во всех позвоночных животных черепных клетки нервного гребня (CNCC) мигрируют из дорсальной части нервной трубки для заполнения глотки арки, которые будут способствовать формированию орофациальных структур. Срыв начале эмбрионального развития нервного гребня может привести к образованию черепно-лицевых пороков развития, включая CL / P 5-7.
В рекламуусловие для структурного сходства между рыбок данио и млекопитающих черепно-лицевого развития (CNCCs проживают в гомологичных областей), регулирующий генная сеть высоко консервативен. Кроме того, было показано, что CNCCs разработать таким же образом, между амниот видов и данио 8, что делает данио мощный организм для изучения развития и генетической основы CL / P. Она имеет много преимуществ, в том числе малого размера, быстрое и экс-маточно эмбрионального развития, и высокий уровень селекции. Кроме того, эмбрион является оптически прозрачным, что делает его доступным наблюдения сложных событий развития под микроскопом 9. Это идеальная модель для животных для изучения миграции и дифференциации черепных клеток нервного гребня.
Развивая ранее опубликованные работы 8, 10, 11, миграционную картину CNCC было подробно описано с помощью SOX10: Kaede трансгенных модели 5. Kaede является фото-кабриолет белок, который туRNS с зеленого на красный после активации фото и позволяет точно проследить CNCCs. Во время этой трансформации пептидный скелет расщепляется, предполагая, что преобразование является стабильным, а это означает, что клетки могут быть отслежены в конечный пункт назначения 12. Трансгенные линии, помеченные Kaede под транскрипционный контроль Sox10 показали, что амниот небо и решетчатая пластинка рыбок данио формируются гомологично путем слияния двусторонних гайморовых протуберанцев (MXP) с фронтоназальной известность (ФНП) и что Y форме слияния шов аналогично между видов.
Среди других приложений, то Sox10: Kaede трансгенных данио модели был использован для создания видео эмбрионов данио на разных стадиях развития, чтобы показать формирование нормальных и ненормальных черепно-лицевых структур. Фотопреобразования конкретных групп клеток позволяет отслеживать их развитие. С помощью этого метода подход к созданию живого изображения разработки craniofacМВЛ структуры в данио вводится, что позволяет легко визуально продемонстрировать этот сложный процесс развития.
Этот протокол направлен на обмен опытом генерации эти видео, используя нормальное развитие решетчатой пластине в Sox10: Kaede трансгенных данио в качестве примера. Этот протокол может дополнительно применяться к созданию покадровой видео любой структуры, полученной из черепных клеток нервного гребня у рыбок данио.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь новый метод визуализации черепно-лицевого развития в данио модели показана. В Sox10: Kaede трансгенных данио линия была успешно используемые для описания миграционную картину CNCC подробно используется в качестве модельного организма 5.
Предыдущие исследования и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Роберт Kelsh за любезно обмена данио Sox10 промоутер реагента.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- . Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
