근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식
Summary
유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.
Abstract
환자 유래 iPSC는 미래의 자가 세포 치료 프로토콜을 위한 세포의 귀중한 근원일 수 있었습니다. iPSC 유래 근생 줄기/전구세포는 pericyte 유래 메소포아세포(iPSC 유래 메산지오블라스트와 같은 줄기/선조 세포: IDEM)와 유사한 근간이 영양증의 다른 형태에 의해 영향을 받는 환자로부터 생성된 iPSC에서 확립될 수 있다. 환자 별 IDEM은 다른전략(예: 렌즈피바이러스 벡터, 인간 인공 염색체)으로 유전적으로 교정될 수 있으며 근추행성 조절기 MyoD의 과발현시 근생 분화 가능성을 향상시킬 수 있다. 이 근생 잠재력은 그 때 특정 분화 분석과 시험관 내 평가되고 면역 형광에 의해 분석됩니다. IDEM의 재생 잠재력은 급성 및 만성 근육 재생을 표시하는 두 개의 대표적인 마우스 모델에서 근육 내 및 동맥 이식시 생체 내에서더 평가됩니다. 숙주 골격 근육에 IDEM의 기여는 이식 된 마우스에서 다른 기능 테스트에 의해 확인됩니다. 특히, 동물의 운동 능력의 개량은 러닝머신 테스트와 함께 연구된다. 세포 이식 및 분화는 이식된 근육에 대한 다수의 조직학적 및 면역형분석서에 의해 평가된다. 전반적으로, 본 논문은 현재 IDEM의 분화 능력을 평가하기 위해 활용되고 있는 분석 및 도구를 설명하며, 이식 방법과 세포 이식의 효능을 분석하기 위한 후속 결과 측정에 초점을 맞추고 있다.
Introduction
중안지오블라스트(MABs)는 복막1-3의하위 집합에서 유래된 혈관 관련 근육 전구체이다. 위성 세포 와 같은 표준 근육 전조를 통해 MABs의 주요 장점은4 동맥 내 전달 될 때 혈관 벽을 교차하는 능력에 상주하므로 세포 치료 프로토콜에서 골격 근 재생에 기여합니다. 이 기능은 근육 이영양증1,5,6의뮤린 및 개 모델 모두에서 평가및 확인되었습니다. 이러한 전임상 연구는 듀첸 근 위축증을 가진 아이들에 있는 기증자 HLA 동일 MABs의 동맥 이식에 근거를 둔 첫번째 인맨 단계 I/II 임상 시험을 위한 기초를 건설했습니다 (EudraCT No. 2011-000176-33; 현재 밀라노의 산 라파엘레 병원에서 가고 있습니다). 세포 치료 접근의 주요 장애물 중 하나, 세포의 수십억 전신의 근육을 치료 하는 데 필요한, “약용 제품”의 제한 된 증식 잠재력 (세포). 더욱이 최근에는 사지 거들 근이영양증 2D(LGMD2D)에서 발생하기 때문에 일부 형태의 근이영양증에 의해 영향을 받는 환자로부터 MAB를 얻을 수 없다는 것이 입증되었습니다. 오마이걸 #608099)7.
이러한 한계를 극복하기 위해 인간 및 뮤린 iPSC로부터 MAB와 같은 줄기/전구 세포를 유도하기 위한 프로토콜이 최근에 수립되었다7. 이 절차는 혈관 유전자 서명 및 면역 페노타입을 가진 쉽게 확장 가능한 세포 인구를 생성합니다 성인 근육 유래 MABs와 매우 유사합니다. 근생 조절 요인 MyoD의 발현시, 뮤린과 인간 IDEM(각각 MIDEM 및 HIDEM)은 말단 골격 근 분화를 겪습니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 IDEM은 구성적으로 또는 유도 할 수없는 방식으로 MyoD 식을 구동 할 수있는 벡터로 변환 할 수 있습니다8-10. 에스트로겐 수용체(MyoD-ER)와 융합된 MyoD cDNA를 함유한 렌즈바이러스 벡터가 사용되어 타목시펜(에스트로겐 유사체) 투여 시 핵 전좌를허용한다(11). 이 전략은 고효율7을가진 비대성 다중 핵처리된 심포우의 형성을 초래한다. 특히, IDEM은 비종양성이며 이식 시 숙주 근육을 이식하고 분화할 수 있으며 다른벡터(예: 렌즈바이러스 또는 인간 인공 염색체)를 사용하여 유전적으로 교정할 수 있으며, 미래의 자가 치료 전략을 위한 길을 열어주고 있습니다. IDEM의 파생, 특성화 및 이식은 상기 간행물7에기재되었다. 본 프로토콜 논문은 IDEM의 체외 근생 분화를 평가하기 위해 수행된 분석서와 근육 재생의 마우스 모델에서 이식의 효능을 테스트하기 위한 후속 결과 측정을 상세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSC는 자기 갱신 잠재력을 보존하면서 무기한 으로 확장될 수 있으므로 광범위한 세포계보(12)로분화하도록 지시될 수 있다. 이와 다른 이유로 iPSC 유래 줄기/전구 세포는 자가 유전자 및 세포 치료에 대한 유망한 원천으로간주됩니다(13)접근한다. 저자로부터 이전에 출판 된 작품은 백혈구 유래 MABs (IDEM)의 것과 유사한 표현형을 가진 iPSCs에서 마우스와 인간 근생 성 전조자의 생성?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 줄리오 코스수, 마르티나 라가지와 도움이 되는 토론과 지원을 위한 전체 실험실, 그리고 제프 체임벌린에게 MyoD-ER 벡터를 친절하게 제공한 것에 대해 감사드립니다. 살아있는 동물과 관련된 모든 실험은 모든 관련 규제 및 기관 기관, 규정 및 지침에 따라 완료되었습니다. 저자 실험실에서 작업은 영국 의학 연구 위원회에 의해 지원됩니다, 유럽 지역 사회 7 프레임 워크 프로젝트 Optistem 및 바이오 디자인과 이탈리아 Duchenne 부모 프로젝트.
Materials
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Non-essential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| 4/11/13 | Cappel | 559762 | |
| Hoechst 33342 | Sigma fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacteric suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30G needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.
References
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