השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים
Summary
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.
Abstract
IPSCs שמקורם בחולה יכול להיות מקור תאים שלא יסולא בפז עבור פרוטוקולים עתידיים של טיפול בתאים אוטולוגיים. תאי גזע/אב מיוגניים שמקורם ב- iPSC בדומה לזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (תאי גזע/אב דמויי iPSC: IDEMs) יכולים להיווצר מ- iPSCs המופקים מחולים המושפעים מצורות שונות של ניוון שרירים. IDEMs ספציפיים למטופל ניתן לתקן גנטית עם אסטרטגיות שונות(למשל, וקטורים lentiviral, כרומוזומים מלאכותיים אנושיים) ומשופר בפוטנציאל הבידול המיוגני שלהם על חשיפת יתר של MyoD הרגולטור myogenesis. פוטנציאל מיוגני זה מוערך לאחר מכן במבחנה עם מבחני בידול ספציפיים ומנותח על ידי כשל חיסוני. הפוטנציאל ההתחדשותי של IDEMs מוערך עוד יותר vivo, על השתלה תוך שרירית תוך עורקית בשני מודלים של עכבר מייצג המציגים התחדשות שרירים חריפה וכרונית. תרומתם של IDEMs לשריר השלד המארח מאושרת לאחר מכן על ידי בדיקות תפקודיות שונות בעכברים מושתלים. בפרט, ההשתלבות של היכולת המוטורית של בעלי החיים נחקרת בבדיקות הליכון. חריטה של תאים ובידול מוערכים לאחר מכן על ידי מספר מבחני היסטולוגיה ואימונופלואורסצנטיות על השרירים המושתלים. בסך הכל, מאמר זה מתאר את הבדיקות והכלים המשמשים כיום להערכת יכולת הבידול של IDEMs, תוך התמקדות בשיטות ההשתלה ובאמצעי התוצאה הבאים כדי לנתח את היעילות של השתלת תאים.
Introduction
Mesoangioblasts (MABs) הם אבות שרירים הקשורים לכלי שמקורם בקבוצת משנה של pericytes1-3. היתרון העיקרי של MABs על אבות שרירים קנוניים כגון תאי לווין4 שוכן ביכולתם לחצות את קיר כלי השיט כאשר מועברים תוך עורקי ולכן לתרום התחדשות שריר השלד בפרוטוקולים טיפול בתא. תכונה זו הוערכה ואושרה הן במודלים מורין והן במודלים של ניוון שרירים1,5,6. מחקרים פרה-קליניים אלה בנו את היסודות לניסוי קליני שלב I/II ראשון באדם המבוסס על השתלת פנים-עורקים של MABS זהה HLA בילדים עם ניוון שרירים דושן (EudraCT מס ‘2011-000176-33; כרגע הולך בבית החולים סן רפאלה של מילאנו, איטליה). אחד המכשולים העיקריים של גישות טיפול בתאים, שבו מיליארדי תאים נדרשים לטיפול בשריר של גוף שלם, הוא הפוטנציאל המשגשג המוגבל של “המוצר הרפואי” (התאים). יתר על כן הוכח לאחרונה כי לא ניתן להשיג MABs מחולים מושפעים על ידי צורות מסוימות של ניוון שרירים, כפי שהוא מתרחשת ניוון שרירים מחוך גפיים 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פרוטוקול להפקת תאי גזע / אב דמויי MAB מ- IPSCs אנושיים ומורין הוקם לאחרונה7. הליך זה מייצר אוכלוסיות תאים הניתנות להרחבה בקלות עם חתימת גן כלי דם ואימונופנוטיפ הדומה מאוד ל- MABs שמקורם בשרירים למבוגרים. עם ביטוי של גורם רגולטורי מיוגני MyoD, הן מורין ו IDEMs אנושי (בהתאמה MIDEMs ו HIDEMs) לעבור בידול שריר השלד סופני. כדי להשיג מטרה זו IDEMs יכול להיות transduced עם וקטורים מסוגלים לנהוג ביטוי MyoD, או מכונן או באופן בלתי ניתן להעברה8-10. וקטור lentiviral המכיל MyoD cDNA התמזגו עם קולטן האסטרוגן (MyoD-ER) משמש, ובכך מאפשר טרנסלוקציה הגרעינית שלה על טמוקסיפן (אנלוגי אסטרוגן) הממשל11. אסטרטגיה זו גורמת להיווצרות של myotubes רב-גרעיני היפרטרופי, עם יעילות גבוהה7. יש לציין, IDEMs הם nontumorigenic, יכול לחרוט ולהבדיל בתוך השרירים המארחים בעת ההשתלה והוא יכול להיות מתוקן גנטית באמצעות וקטורים שונים(למשל lentiviruses או כרומוזומים מלאכותיים אנושיים), סולל את הדרך אסטרטגיות טיפוליות אוטולוגיות בעתיד. הנגזרת, האפיון וההשתלה של IDEMs תוארו בפרסוםלעיל 7. נייר פרוטוקול זה מפרט את הבדיקות שבוצעו כדי להעריך את הבידול המיוגני במבחנה של IDEMs ואת מדידות התוצאה הבאות כדי לבדוק את היעילות של ההשתלה שלהם במודלים העכבר של התחדשות שרירים.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSCs ניתן להרחיב ללא הגבלת זמן תוך שמירה על פוטנציאל ההתחדשות העצמית שלהם ובכך להיות מופנה להבדיל למגוון רחב של שושלת התא12. מסיבות אלה ואחרות תאי גזע/אב שמקורם ב- iPSC נחשבים למקור מבטיח לטיפול אוטולוגי בגנים ובתאים מתקרבל -13. עבודה שפורסמה בעבר מן המחברים דיווחה על הדור של עכברים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לג’וליו קוסו, מרטינה רגאזי ולכל המעבדה על דיון ותמיכה מועילים, וג’ף צ’מברליין על שסיפק בחביבות וקטור MyoD-ER. כל הניסויים בבעלי חיים חיים הושלמו בהתאם לעמידה בכל הגופים הרגולטוריים והמוסדיים הרלוונטיים, תקנות והנחיות. העבודה במעבדת המחברים נתמכת על ידי המועצה למחקר רפואי בבריטניה, הקהילה האירופית 7 פרויקטים Optistem ו Biodesign ופרויקט ההורה האיטלקי דושן.
Materials
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Non-essential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| 4/11/13 | Cappel | 559762 | |
| Hoechst 33342 | Sigma fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacteric suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30G needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
