Mesurer la croissance et Gene Expression Dynamique de tumeur ciblée<em> S. Typhimurium</em> Bacteria
Summary
Le but de ces expériences est de générer des données temps-parcours quantitatives sur la croissance et la dynamique de l'expression des gènes des atténué<em> S. typhimurium</em> Colonies bactériennes croissantes à l'intérieur des tumeurs. Cette vidéo couvre la préparation des cellules tumorales et l'implantation, la préparation de bactéries et d'injection, l'imagerie animal entier luminescence, excision de la tumeur, et le comptage de colonies bactériennes.
Abstract
Le but de ces expériences est de générer des données temps-parcours quantitatives sur la croissance et la dynamique de l'expression des gènes de S. atténué colonies bactériennes typhimurium croissance à l'intérieur des tumeurs.
Nous avons généré des modèles de xénogreffes de tumeurs chez la souris par injection sous-cutanée d'une lignée de cellules de cancer ovarien humain, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).
Nous avons transformé des souches atténuées de S. bactéries typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) avec une luciférase exprimée de façon constitutive (luxCDABE) plasmide pour la visualisation 2. Ces souches colonisent spécifiquement les tumeurs tout en restant essentiellement non virulente pour la souris 1.
Une fois les tumeurs mesurables ont été établis, les bactéries ont été injectés par voie intraveineuse via la veine queue avec dosage variable. La tumeur localisée, l'expression du gène bactérien a été suivie en temps réel au cours de 60 heures en utilisant undans le système d'imagerie in vivo (IVIS). A chaque instant, les tumeurs ont été excisés, homogénéisés, et étalées pour quantifier colonies bactériennes pour la corrélation avec les données d'expression génique.
Ensemble, ces données donne une mesure quantitative de la croissance in vivo et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries qui se développent à l'intérieur des tumeurs.
Introduction
La biologie synthétique a progressé rapidement au cours de la dernière décennie et est maintenant positionné à l'impact des problèmes importants dans l'énergie et la santé. Cependant, l'expansion dans le domaine clinique a été ralentie par des problèmes de sécurité et l'absence d'élaborer des critères de conception pour les circuits génétiques in vivo. Accélération des applications médicales à fort impact, il faudra utiliser des méthodes qui s'interfacent directement avec les infrastructures médicales, les circuits génétiques qui fonctionnent en dehors de l'environnement de laboratoire contrôlé, et les hôtes microbiens sûrs et cliniquement acceptée.
Un certain nombre de souches ont été étudiés pour le traitement du cancer en raison de leur capacité à se développer de manière préférentielle dans les tumeurs. Celles-ci ont inclus C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum et S. typhimurium 3-8. S. typhimurium a suscité un intérêt particulier car ils ont montré la sécurité et la tolérance dans un certain nombre d'essais cliniques humains 9-12. Ces bacteri un été initialement montré pour créer des effets anti-tumoraux par la stimulation du système immunitaire de l'hôte et de l'épuisement des nutriments nécessaires au métabolisme des cellules cancéreuses. La production de marchandises thérapeutique a été ajouté plus tard grâce à des modifications génétiques. Bien que ces études représentent des avancées importantes dans l'utilisation de bactéries pour les thérapies tumorales, la majorité des efforts actuels se sont appuyés sur l'expression de haut niveau qui se traduit généralement par la livraison des doses élevées, les effets hors-cible, et le développement de la résistance de l'hôte 13-16 .
Maintenant, la biologie synthétique peut ajouter la production de marchandises programmable en utilisant des circuits génétiques calcul conçues qui peuvent effectuer la détection et la livraison 17-20 avancés. Ces circuits peuvent être conçus pour agir en tant que systèmes de distribution qui détectent des stimuli spécifiques de la tumeur et l'auto-régulation de la production de marchandises que nécessaire. Cependant, l'étude de la fonction de ces circuits in vivo a été jusqu'ici difficile.
ve_content "> Depuis plasmides sont le cadre commun pour les circuits de synthèse, nous décrivons une méthode pour caractériser la dynamique de l'expression génique à base de plasmides in vivo utilisant un modèle de souris. Ces méthodes utilisent l'imagerie de luminescence time-lapse et la mesure quantitative de biodistribution. Ensemble, ces approches fournissent un cadre pour l'étude des réseaux à base de plasmide in vivo pour des applications cliniques.Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant cette procédure, nous sommes en mesure de générer des cours à temps pour la croissance et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries colonisant les tumeurs. Bien que ces mesures sont régulièrement effectuées in vitro en culture batch ou dispositifs microfluidiques, ils sont beaucoup plus difficiles à réaliser in vivo.
Il ya plusieurs modifications qui peuvent être appliquées à ces méthodes. Alors que nous avons utilisé la lignée c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions H. Fleming pour la lecture et l'édition critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale Misrock (TD) et NDSEG bourse d'études supérieures (AP). SNB est un chercheur du HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
- Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
- Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
- Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
- Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
- Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
- Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. 암 연구학. 57 (20), 4537-4544 (1997).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
- Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
- Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
- Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
- Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
- Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
- Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
- Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. 암 연구학. 70 (1), 18-23 (2010).
- Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. 암 연구학. 66 (15), 7647-7652 (2006).
- Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
- Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
- Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
- Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
- Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
- Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
- Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
- Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).
