Mäta tillväxt och Gene Dynamics Expression av tumör-Targeted<em> S. Typhimurium</em> Bakterier

Summary

Målet med dessa försök är att generera kvantitativa tidsförlopp uppgifter om tillväxt och Gene dynamik uttryck av försvagad<em> S. typhimurium</em> Bakteriekolonier växer inuti tumörer. Denna video behandlar tumörcellen förberedelse och implantation, bakterier förberedelse och injicering, hel-djur luminiscens bildbehandling, tumör excision, och bakteriell koloniräkning.

Abstract

Målet med dessa försök är att generera kvantitativa tidsförlopp uppgifter om tillväxt och Gene dynamik uttryck av försvagad S. typhimurium kolonier växer inuti tumörer.

Vi genererade tumörer modell xenograft hos möss genom subkutan injektion av en human äggstockscancer cellinje, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumör Repository, Frederick, MD).

Vi förvandlas försvagade stammar av S. typhimurium bakterier (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) med en konstitutivt uttryckt luciferas (luxCDABE) plasmid för visualisering ^2. Dessa stammar kolonisera specifikt tumörer medan resterande väsentligen icke-virulent för musen ^1.

När mätbara tumörer etablerades, var bakterier injicerades intravenöst via svansvenen med varierande dosering. Tumör-lokaliserad, var bakteriell genexpression övervakas i realtid under loppet av 60 timmar med användning av enin vivo imaging system (IVIS). Vid varje tidpunkt, var tumörerna skars ut, homogeniserades och ströks för att kvantifiera bakteriella kolonier för korrelation med data genuttryck.

Tillsammans ger dessa data ett kvantitativt mått på in vivo tillväxt och Gene dynamik uttryck av bakterier växer inuti tumörer.

Introduction

Syntetisk biologi har utvecklats snabbt under det senaste decenniet och är nu positionerade för att påverka viktiga problem inom energi och hälsa. Dock har expansion i kliniska arenan har saktat av oro för säkerheten och en frånvaro av att utveckla specifika kriterier för in vivo genetiska kretsar. Accelerera stor genomslagskraft medicinska tillämpningar kommer att kräva användning av förfaranden som har gränssnitt direkt med medicinsk infrastruktur, genetiska kretsar som fungerar utanför den kontrollerade labb miljö, samt säkra och kliniskt accepterade värdar mikrobiella.

Ett antal stammar har undersökts för cancerterapi på grund av deras förmåga att växa preferentiellt i tumörer. Dessa har inkluderat C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, och S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium har genererat särskilt intresse eftersom de har ställt säkerhet och tolerans i ett antal kliniska prövningar ^9-12. Dessa bacteri en ursprungligen visats skapa antitumöreffekter genom stimulering av värdens immunsystem och genom utarmning av näringsämnen som krävs för cancer cellernas ämnesomsättning. Produktionen av terapeutisk last senare tillkommit genom genetiska modifieringar. Även om dessa studier utgör viktiga framsteg i användningen av bakterier för tumörläkemedel, har majoriteten av befintliga insatser förlitat sig på hög nivå uttryck som oftast resulterar i leverans av höga doser, off-target effekter och utveckling av värdresistens ^13-16 .

Nu kan syntetisk biologi lägga programmerbar last produktionen genom att utnyttja beräkningsmässigt utformade genetiska kretsar som kan utföra avancerade sensorer och leverans ^17-20. Dessa kretsar kan utformas för att fungera som leveranssystem som känner tumör-specifika stimuli och självreglering last produktion som behövs. Emellertid har studera funktionen av dessa kretsar i vivo hittills varit utmanande.

ve_content "> Eftersom plasmider är den gemensamma ramen för syntetiska kretsar, beskriver vi en metod för att karaktärisera dynamiken i plasmid-baserad genuttryck in vivo med hjälp av en musmodell. Dessa metoder utnyttjar time-lapse luminiscens bildbehandling och kvantitativ mätning av biofördelningen. Tillsammans Dessa metoder ger en ram för att studera plasmid-baserade nätverk in vivo för kliniska tillämpningar.

Protocol

Ett. Cellberedning Passage cellinjer med användning av standardtekniker för cellodling. I detta experiment använde vi OVCAR-8 celler (NCI DCTD Tumör Repository, Frederick, MD). Odla celler till ett mål konfluens av 80 – 100%. Inkubera cellerna med 5 ml trypsin under 5 minuter, tillsätt sedan 5 ml RPMI medium + FBS att inaktivera trypsin. Harvest och räkna cellerna på en hemocytometer. Resuspendera i fenolrött-fritt DMEM vid en målkoncentration av 5 x 10 7 celler / ml, …

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll, kan vi ta fram data om in vivo-tillväxt och Gene dynamik uttryck av Tumor Targeted bakterier. Den övergripande arbetsflödet sammanfattas i Figur 1. I det första steget, injicera vi bakterier (grön) och image djuret med IVIS att mäta genuttryck med luminiscens (blått) som en reporter. Sedan, i det andra steget, vi punktskatter, homogenisera och platta tumörer för kolonier att bestämma antalet bakte…

Discussion

Med hjälp av denna procedur, kan vi generera tidsförlopp för tillväxt och Gene dynamik uttryck av bakterier koloniserar tumörer. Medan dessa mätningar rutinmässigt in vitro i satsvis odling eller mikrofluidik-enheter, de är mycket svårare att utföra in vivo.

Det finns flera modifikationer som kan tillämpas på dessa metoder. Medan vi använde OVCAR-8 cellinje för att skapa våra musmodeller, kan ett antal andra cellinjer användas ekvivalent. Exempelvis kan luci…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	BD Biosciences	309602
3/10 cc Insulin Syringe	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine	Invitrogen	11875-119
Ampicillin	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Broth	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani broth	BD Biosciences	244610