A Human<em> Ex Vivo</em> Placa aterosclerótica modelo para estudar Lesão Biologia

Summary

A aterosclerose é um processo inflamatório crônico. Este manuscrito ilustra um fácil de usar modelo ex vivo para investigar carótida fresco ou placas nas artérias coronárias. O modelo ex vivo permite a investigação de substâncias potenciais sobre o meio inflamatório nas lesões ateroscleróticas humanas e os resultados podem ser analisados ​​através de vários métodos.

Abstract

A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica da vasculatura. Existem vários métodos para estudar o composto inflamatório nas lesões ateroscleróticas. Modelos de rato são um instrumento importante para investigar os processos inflamatórios na aterogénese, mas estes modelos sofrem das diferenças fenotípicas e funcionais entre o murino e sistema imunológico humano. Em experiências in vitro de células são usadas para avaliar especificamente células alterações dependentes do tipo causada por uma substância de interesse, mas variações dependentes de cultura e a incapacidade para analisar a influência de moléculas específicas no contexto do composto inflamatório nas lesões ateroscleróticas limitar o impacto dos resultados. Além disso, os níveis de uma molécula de interesse, em sangue humano medição ajuda a continuar a investigar a sua relevância clínica, mas isto representa a inflamação sistémica e não local. Portanto, temos aqui descrever um modelo de cultura de placa para estudar a biologia da lesão aterosclerótica humanaex vivo. Em suma, placas novas são obtidos de pacientes submetidos a endarterectomia ou revascularização do miocárdio e armazenados em meio RPMI no gelo até o uso. As amostras foram cortadas em pedaços pequenos, seguido por distribuição aleatória em uma placa de 48 poços, contendo meio RPMI em adição a uma substância de interesse, tais como citocinas ou quimiocinas, isoladamente ou em combinação, por períodos de tempo definidos. Após a incubação, as peças da placa pode ser congelado de choque para o isolamento de mRNA, embebidos em parafina ou outubro para coloração imuno-histoquímica ou esmagado e lisadas por western blotting. Além disso, as células podem ser isoladas a partir da placa por análise de citometria de fluxo. Além disso, os sobrenadantes podem ser recolhidas para a medição da proteína por meio de ELISA. Em conclusão, o modelo ex vivo apresentado abre a possibilidade de estudar ainda a biologia lesional inflamatória, o que pode resultar na identificação de novos mecanismos de doença e alvos terapêuticos.

Introduction

A aterosclerose como uma doença inflamatória crônica é uma das principais causas de morte nos países industrializados ^1-2. As complicações da aterosclerose, síndromes coronárias agudas, especialmente, têm sido associados a ruptura das lesões vulneráveis, causando aterotrombose e oclusão do vaso ^3. A imunidade inata e adaptativa parecem estar envolvidos em todas as etapas da aterogênese ^2,4-5. Embora o progresso significativo foi feito no tratamento do infarto agudo do miocárdio, a prevenção eficaz da aterosclerose e eventos cardiovasculares adversos ainda estão por resolver. Assim, estudando biologia lesional é essencial para aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia da aterosclerose e para permitir a identificação de novos alvos terapêuticos e desenvolvimento de novas terapias.

Em muitos casos, os modelos de murino são utilizados para investigar a patofisiologia de doenças específicas. No entanto, o estudo aterogênese utilizando modelos de ratos é acomodaçãompanied por várias limitações: (1) Normalmente, os ratos ateroscleróticas receber uma dieta rica em colesterol. Os níveis de colesterol nesses modelos não podem ser comparadas com as de pacientes com níveis elevados de colesterol no soro ^6. (2) Existem diferenças substanciais entre a murino e sistema imunológico humano; assim Foxp3 é um marcador específico de células T reguladoras de murino, enquanto que a expressão de Foxp3 humana em células T humanas não necessariamente conferir um fenótipo de regulação ^7. Além disso, o paradigma Th1/Th2 como definido em seres humanos não é inteiramente transferida para as células T de murino. (3) Um número de marcadores que são utilizados para identificar os monócitos e macrófagos de murino, tais como F4/80 e marcadores de clássica (M1) vs alternativa (M2) Os padrões de activação não existe nas células mielóides humanas ^8. (4) A expressão dos genes de monócitos do sangue periférico de murídeo e humanos foi encontrado para ser substancialmente diferente ^9.

Assim, a fim de aumentar a compreensão dasprocessos inflamatórios crônicos na aterosclerose humana, precisamos fazer uso de modelos que trabalham com tecidos humanos, sangue ou células. Aqui, descrevemos um modelo de cultura de tecidos placa humano, o que permite a investigação de substâncias novas potenciais no conceito de biologia lesional inflamatório humano.

Protocol

1. Preparar meio da seguinte Meio de Cultura: meio RPMI. Adicionar 10% de soro fetal de vitelo (FCS). Adicionam-se 100 U / ml de penicilina G, e 100 g / ml de estreptomicina. 2. Armazenamento de cilindros de placa fresco até o uso A operação de endarterectomia de carótida de pacientes com ou sem sintomas isquêmicos (derrame cerebral, ataque isquêmico transitório), com estenose importante da artéria carótida será feito por cirurgiões …

Representative Results

Aqui nós apresentamos uma série de figuras que demonstram resultados da ex vivo placa de cultura. Para avaliar as mudanças no ambiente inflamatório em resposta ao agente de interesse no modelo ex vivo experimento, medimos moléculas diferentes que são conhecidos por serem primariamente envolvidos na aterogênese. Como citocinas pró-aterogênico representativos escolhemos TNFa, IL6 e IFNg 2,11. Além disso, usamos o fator de von Willebrand e fator tecidual para avaliar as mudanças pró…

Discussion

Aqui apresentamos um modelo de cultura ex vivo placa para investigar a influência de substâncias potencialmente relevantes sobre a biologia da lesão aterosclerótica. A principal vantagem deste método ex vivo é a capacidade de avaliar a influência das substâncias indicadas nas células inflamatórias e a sua interacção celular, bem como vias inflamatórias e cascatas em lesões ateroscleróticas humanas. Vários métodos utilizáveis ​​(por exemplo, RT-PCR, Western blot, imuno-his…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Gibco	21875-091	n/a
FCS	Gibco	10270-106	n/a
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458	n/a
15 ml tube	Sarstedt	62,554,502	n/a
culture dish (60mm)	Orange Scientific	5550200	n/a
LPS	Sigma	L4516	n/a
Cell Culture Plates 48-well	Greiner	677102	n/a
Scalpel – single use	Feather	FEA200130011	n/a
TissueLyser	Precellys 24 Dual	Cat. No. EQ03119.200.RD010.0	n/a
RNeasy (Mini) Kit	Qiagen	Cat. No. 74104	n/a
Boehringer cDNA kit	Roche Diagnostics	Cat. No. 11483188001	n/a
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific		n/a