דור של תת עורי וintrahepatic אדם xenografts קרצינומה hepatocellular בעכברים עם מערכת חיסון חלשים
Summary
xenografts גידול האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים הם כלים רבי ערך כדי ללמוד ביולוגיה בסרטן. פרוטוקולים ספציפיים כדי ליצור xenografts תת עורי וintrahepatic מתאי אנושיים hepatocellular קרצינומה או שברי גידול מתוארים. התחדשות כבד הנגרמת על ידי כריתה חלקית בעכברי נמען מוצגת כאסטרטגיה כדי להקל על קליטתם intrahepatic.
Abstract
In vivo מודלים ניסיוניים של קרצינומה hepatocellular (HCC) כי לשחזר את המחלה האנושית מספקים פלטפורמה רבת ערך למחקר להפתופיזיולוגיה מחלה ולהערכה קליני של טיפולים חדשניים. אנו מציגים מגוון רחב של שיטות ליצירה תת עורית או xenografts HCC האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים orthotopic שיכול להיות מנוצל במגוון רחב של יישומי מחקר. עם דגש על השימוש ברקמת גידול ראשונית מחולים שעברו כריתה כירורגית כנקודת התחלה, אנו מתארים את ההכנה של השעיות תא או שברי גידול לxenografting. אנו מתארים טכניקות ספציפיות לxenograft רקמות אלה תת עורי), או ii) intrahepatically, או על ידי השתלה ישירה של תאים סרטניים או שברים בכבד, או בעקיפין על ידי הזרקה של תאים לתוך טחול העכבר. אנו גם מתארים את השימוש של כריתה החלקית של כבד עכבר הילידים בזמן xenografting כאסטרטגיה ללגרום למצב של התחדשות כבד פעילה בעכבר הנמען שעשוי להקל על קליטתם intrahepatic של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים. התוצאות הצפויות של טכניקות אלה באים לידי ביטוי. הפרוטוקולים שתוארו אומתו באמצעות דגימות אנושיות ראשוני HCC וxenografts, אשר בדרך כלל לבצע פחות וחסונה יותר משורות תאי HCC האנושי המבוססות היטב כי נמצא בשימוש נרחב ומצוטטות לעתים קרובות בספרות. בהשוואה לשורות תאים, אנו דנים גורמים אשר עשוי לתרום לסיכוי הנמוך יחסית של engraftment HCC העיקרי במודלי xenotransplantation ולהגיב על בעיות טכניות שעלולות להשפיע על קינטיקה של צמיחת xenograft. אנחנו גם מציעים שיטות שיש ליישם כדי להבטיח שxenografts השיגה במדויק דומה רקמות HCC הורה.
Introduction
קרצינומה hepatocellular (HCC) היא הסרטן החמישי הנפוץ ביותר בעולם והסיבה הכי בקצב המואץ למוות מסרטן בצפון אמריקה. גורם הסיכון הנפוץ ביותר עבור HCC הוא שחמת כבד, בתדירות הגבוהה ביותר מתרחש עקב דלקת כבד כרונית נגיפית, שימוש לרעה באלכוהול, מחלות אוטואימוניות, או הפרעות מטבוליות תורשתיות 1.
למרות נטל מחלת הכבד שהוטל על ידי HCC על אוכלוסיות ברחבי העולם, הפתופיזיולוגיה של HCC מובנת יחסית גרוע בהשוואה לסוגי סרטן שכיח אחרים כגון מעי גס, שד, או סרטן הערמונית. לדוגמא, אירועים מולקולריים ותאיים ספציפיים נהיגה tumorigenesis להישאר להיות מוגדרים 2 באופן ברור. כמו רוב סוגי סרטן אפיתל מוצקים אחרים, גישות הגנומי חשפו את ההטרוגניות בסטיות קשורות עם HCC 3. מספר המחקרים גילו פעילות מסודרות של מגוון רחב של מסלולי איתות מעורבים בהתפשטות תאים, survival, בידול ואנגיוגנזה 4. בנוסף, תפקידם של תאי גזע סרטני בpathobiology HCC נשאר להתברר 5.
עם הבנה מוגבלת של הפתופיזיולוגיה HCC, בארסנל של טיפולים יעילים לHCC גם נשאר מוגבל יחסית. חולים בשלב מוקדם, עם גידולים מוגבלים לכבד הם מועמדים לטיפול מרפא באמצעות אבלציה גידול או כריתה כירורגית, אם כי ההישנות היא שכיחה. עבור חולים עם מחלה מתקדמת יותר, כימותרפיה והקרנות הם בעלי יעילות מוגבלת ומשמשים בעיקר לבקרת מחלות בכוונה פליאטיבי 6.
באיכות גבוהה במודלי ניסויי vivo של HCC האנושי ובכך מספקת פלטפורמה רבת ערך למחקר בסיסי נחוץ להפתופיזיולוגיה של HCC האנושי, כמו גם להערכה של גישות טיפוליות חדשניות. בהשוואה לשימוש בשורות תאים או מודלים עכבר מוגדרים מאוד, xenografts של פריגידולים אנושיים בעכברים עם מערכת חיסון חלשים מרי צמחו ככלים רבי ערך למחקרים מסוג זה שכן הם מסוגלים משחזרים מחלות של בני אדם עם נאמנות גבוהה גם בעת לכידת הטרוגניות שקיימת בתוך ובין חולים השונים 7,8. לשם כך, פיתחנו מגוון רחב של שיטות להקמת xenografts HCC האנושית בעכברים עם מערכת חיסון חלש. בעוד שרוב המחקרים שפורסמו מעורבים xenografts HCC לתאר את השימוש בשורות תאי HCC האנושי מבוססות היטב למטרה זו, אנו מתמקדים באופטימיזציה של מבחני שלנו כדי ליצור xenografts מדגימות HCC עיקריות מתקבלת מייד לאחר כריתה כירורגית של חולים.
טכניקות xenografting שונות עשויות להידרש למחקר יישומים שונים. לדוגמא, xenografts תת עורי שנוצרה מתוך שברי גידול נוצרות במהירות, נמצאת במעקב בקלות, ועשוי להיות מתאים יותר לממשל מקומי של הרפוי רומן עם נוחניטור של תגובת גידול. xenografts intrahepatic עשויה להיות רלוונטית יותר למחקרים הנוגעים לתפקידו של המיקרו בכבד בביולוגיה HCC. Xenografts שנוצרה מהשעיות תא גידול נחוצות לזיהוי והאפיון של תת תא ייזום גידול או לניסויים הדורשים במניפולציות מבחנה של תאים סרטניים לפני xenotransplantation. וכך פיתחנו ומאומתים הפרוטוקולים הבאים להקים תת עורית או xenografts intrahepatic מהשעיות תא או שברי גידול נבעו מדגימות HCC האנושי ראשוניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו תארנו מגוון של טכניקות כדי להקים תת עורי וxenografts HCC האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים intrahepatic שיכול להיות מיושמים על מגוון רחב של שאלות ומבחנים ניסיוניים. בעוד xenografts תת עורי הייתה בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה HCC, xenografts intrahepatic מתוארות בספרות רק לע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכון קנדי לבריאות מחקר שלב 1 המטפל-פרס מדען (AG) ושל גרנט תפעולי מהאגודה לחקר הסרטן (AG). המחברים מודים לד"ר ג'ון דיק לתמיכה בפרויקט זה שלו.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| LORIS 10% PVP-I Solution | LERNA Pharma Inc. | 109-09 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8″ taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100×20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1×2 teeth, 4-1/2″ | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4″ | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4″ | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2″ | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4″ | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2″ | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2″ | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B. Hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med. 365, 1118-1127 (2011).
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma–a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal “capillarization” in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L. Fibrosis-dependent mechanisms of hepatocarcinogenesis. Hepatology. 56, 769-775 (1002).
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
