Vurdering af Forskelle i Sperm konkurrenceevne i<em> Drosophila</em

Summary

Differential sperm konkurrenceevne blandt<em> Drosophila</em> Mænd med forskellige genotyper kan konstateres gennem double-parring eksperimenter. Hver af disse eksperimenter involverer en af ​​hannerne af interesse og en reference han. Let identificerbart markører i afkommet tillader inferens af fraktionen enkeltpersoner far til hver han.

Abstract

Konkurrencen mellem conspecifikt mænd for gøde æg er en af de mekanismer af seksuel selektion, dvs udvælgelse, der opererer på at maksimere antallet af vellykkede parring begivenheder snarere end på maksimering overlevelse og levedygtighed ^1.. Sperm konkurrence repræsenterer konkurrence mellem mænd efter kopulerende med samme kvindelige ^2, hvor sæd er tilfældige i tid og rum. Dette fænomen er blevet rapporteret i flere arter af planter og dyr ^3.. For eksempel vildtfangede D. melanogaster hunner normalt indeholder sædceller 2-3 hanner ^4.. Sæden opbevares i specialiserede organer med begrænset lagerkapacitet, hvilket kunne føre til den direkte konkurrence af sæd fra forskellige hanner ^2,5.

Sammenligning sperm konkurrenceevne forskellige hanner af interesse (eksperimentelle mandlige typer) er blevet udført gennem kontrolleret dobbelt parring eksperits i laboratoriet ^6,7. Kort fortalt er en enkelt kvinde udsat for to forskellige hanner i træk, et eksperimenterende han og en cross-parring henvises han. Den samme parring Ordningen er derefter fulgt ved hjælp af andre eksperimentelle mandlige typer og dermed letter den indirekte sammenligning af den konkurrencemæssige evne sæd gennem en fælles reference. Fraktionen af individer Hendes far de eksperimentelle og reference hanner er identificeret ved hjælp af markører, der tillader en at estimere sperm konkurrenceevne ved hjælp af simple matematiske udtryk ^7,8. Desuden kan sperm konkurrenceevne estimeres i to forskellige scenarier afhængigt af, om den eksperimentelle mandlige er andet eller først at parre (angreb og forsvar assay henholdsvis) ^9, som antages at være reflekterende af forskellige kompetence attributter.

Her beskriver vi en fremgangsmåde, der hjælper til at udspørge den rolle forskellige genetiske faktorer, der formodentlig ligger til grund than fænomenet sperm konkurrenceevne i D. melanogaster.

Introduction

Da Geoff Parker bemærkede forekomsten af sperm konkurrence på insekter og dets evolutionære konsekvenser ^2, har en bølge af undersøgelser i Drosophila og andre arter har forsøgt at kaste lidt lys over dette fænomen på mange forskellige niveauer. Nogle eksempler på områder af interesse har været undersøgelse af dens variation i naturlige populationer ^9,10, dens genetiske arkitektur og relevansen af underliggende genetiske faktorer ^11-14, og dens rolle i kørsel coevolution mellem kønnene ^15,16. I D. melanogaster hunner, den begrænsede kapacitet af de specialiserede sæd-storage organer, et par spermatheca og skelsættende beholder ^6,17, bidrager til konkurrencen af sæd fra forskellige hanner. Ca. 1.500 sædceller overføres under parring til den kvindelige, men kun ~ 500 kan rummes i de nævnte organer ^18,19. I laboratoriet kontrolleret dobbelt-parring erfamenter, der involverer en reference mandlig og en eller flere hanner af interesse er blevet flittigt brugt til evaluering sperm konkurrenceevne ^7,8.

Sperm konkurrenceevne anslås som andelen af efterkommere far er den eksperimentelle hanhund i double-parring eksperimenter over den samlede afkom, dvs fra både eksperimenterende og reference-hanner. Sperm konkurrenceevne, omfatter to elementer, der hver især vurderet i en separat analyse. I overtrædelsen analysen, evne til den eksperimentelle mandlige sædceller til at fortrænge sæd fra den første mandlige dvs henvisningen mandlige, vurderet er. Omvendt i forsvaret assay, evne til den eksperimentelle mandlige sædceller modstå forskydning eller for at reducere befrugtning succes henvisningen mandlige sædceller bliver vurderet. Afhængigt af hvilken type assay, forsvar og angreb, er sæd konkurrenceevnen estimeret gennem scorerne P ₁ eller P _2, hhv. P₁ og P ₂ kan kun antage værdier mellem 0 og 1. Mellemliggende værdier normalt fortolkes som indirekte bevis af sædceller blanding, hvilket tyder på en fysiologisk scenario med direkte sperm konkurrence. Efter samme rationale, kan ekstreme værdier tolkes som bevis for en stærk differentieret sperm konkurrenceevne. Tidlige undersøgelser viste, at P ₂ i D. melanogaster er over 0,8 stigende som den forløbne tid mellem de to parringer forlænger ^7.. Denne samme eksperimentelle design er blevet anvendt i andre Drosophila arter, P ₂ er den almindeligt anvendte statistik i undersøgelser for at evaluere sperm konkurrenceevne ^20.. For de fleste arter er P ₂ værdierne for de testede stammer højere end 0,6 ^21.. Ikke desto mindre kan flere andre mekanismer ikke er relateret til den direkte konkurrence mellem sæd fra forskellige hanner giver identiske scores (se diskussionen).

Distinguishing afkom far er den første eller anden hanner er mulig ved hjælp af let identificerbare markører. I tidlige studier blev en af hannerne bestrålet ved subletale doser, for eksempel røntgenstråler, således at stort set alle æg befrugtet af bestrålet sæd undladt at udklække ^7.. Efterfølgende har mutationer ændrer øje pigmentering eller vingeform været de mest almindeligt anvendte markører. Eksempler på førstnævnte er mutationerne legemsvægt (brun) ⁹ cn (cinnober) ²² og w (hvid) ^23, mens mutation CY (Curly) ²⁴ svarer til den anden type fænotyper, og nogle af disse mutationer er blevet kombineret i samme individ, fx cn kropsvægt. I mindre grad har allozymes ²⁵ og mikrosatellitter ^26,27 med kendte arv mønstre også blevet brugt.

Det eksperimentelle design til at teste for forskelle isperm konkurrenceevne beskrives her følger det væsentlige, at i Clark et al. ^9.. Resultaterne af disse eksperimenter giver information udelukkende om forskellen faderskabet til de eksperimentelle mandlige typer under kontrol. Analyser, der også tage højde for post-befrugtning forskelle i fitness ^14,28 og sæd visualiseringsteknikker ²⁴ muliggøre forskelle i P ₁ (eller P ₂₎ score fortolkes således, at forskelle i sædceller kompetence.

Figur 1 skitserer rationale for både overtrædelse og de ​​forsvarsmekanismer assays. For at illustrere logistikken af processen, en lovovertrædelse eksperiment udført i D. melanogaster ¹⁴ vil blive forklaret i detaljer. Denne særlige handling assay blev anvendt til at teste for en målelig effekt af multigenfamilie Sperm-specifik dynein mellemliggende kæde (SDIC) på sæd konkurrenceevne. Alle medlemmets denne multigenfamilie bor i tandem på X-kromosomet. Knockout hanner blev genereret ved at slette SDIC klynge. Fordi den slettede segment omfattede også essentielle gen korte vinge (SW) og formålet med studiet var at evaluere relevansen af SDIC har mænd bærer SDIC-sw deletion reddet af en transgen kopi af sw (symboliseret som P {SW} , der også gennemført en mini-hvid reportergen) på kromosom 2.. Øjenfarve blev anvendt som en synlig markør for faderskab identifikation. Alle fluer var i en hvid mutant baggrund med undtagelse af dem fra stammen Oregon-R, som blev anvendt som reference-hanner.

Protocol

Små eksperimenter bør udføres for at blive fortrolig med hele proceduren. 1.. Indsamling Virgin Hunner og Naive Mænd Den simpleste version af den skitserede eksperiment består af fire typer af indledende kors, som involverer følgende kombination af voksne: a) w 1118 enkeltpersoner med henblik på at indsamle jomfruelige hunner, b) Oregon-R enkeltpersoner med henblik på at indsamle naive referencepunkter hanner c ) P {SW} homozygo…

Representative Results

Tabel 2 sammenfatter nogle væsentlige træk ved to lovovertrædelse eksperimenter (Analyser 1 og 2), hvor D. melanogaster eksperimentelle mænd med og uden (type I og II, henholdsvis) en funktionel SDIC klynge sammenlignes 14.. Efter at have taget hensyn til de forskellige hændelser stødt med nogle gentagelser, blev der 58-83% af hunnerne fundet at være informativ og derfor faderskab tællinger af deres afkom kunne anvendes til beregning af P 2. Resultaterne a…

Discussion

Vi har beskrevet den eksperimentelle design til at vurdere forskelle i relative bidrag genetisk forskellige D. melanogaster hanner til afkommet i kontrollerede dobbelt parring eksperimenter ^7,8. Dette er sket i forbindelse med en genetisk faktor hypotese at påvirke sperm konkurrenceevne og det er blevet illustreret i overtrædelsen assay selvom en lignende procedure gælder for forsvaret assay (figur 1). Denne eksperimentelle design kan modificeres til at teste andre aspekter af fad…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes