Vurdere Forskjeller i Sperm konkurransekraft i<em> Drosophila</em

Summary

Differential sperm konkurranseevne blant<em> Drosophila</em> Menn med forskjellige genotyper kan fastslås gjennom dobbel-parring eksperimenter. Hvert av disse forsøk involverer en av hanner av interesse og et referanse hann. Lett identifiserbare markører i avkommet tillate slutning av brøkdel av individer far etter hvert hann.

Abstract

Konkurransen blant conspecific menn for gjødsling ova er en av mekanismene for seksuell seleksjon, det vil si utvalg som opererer på å maksimere antall vellykkede parring hendelser snarere enn på å maksimere overlevelse og levedyktighet ^en. Spermolje konkurranse representerer konkurransen mellom hanner etter copulating med de samme ^세스 hunn, hvor deres spermier er tilfeldig i tid og rom. Dette fenomenet har blitt rapportert i flere arter av planter og dyr ^3. For eksempel, villfanget D. melanogaster kvinner vanligvis inneholde sædceller 2-3 hanner ^fire. Sæden lagres i spesialiserte organer med begrenset lagringskapasitet, noe som kan føre til direkte konkurranse av sperm fra forskjellige menn ^2,5.

Sammenligning av sperm konkurranseevne forskjellige hanner av interesse (eksperimentelle mannlige typer) er utført gjennom kontrollert dobbelt-parring experiments i laboratoriet ^6,7. Kort fortalt er en singel kvinne utsatt for to forskjellige menn etter hverandre, en eksperimentell mannlige og en cross-parring referansen hann. Det samme parring ordningen blir så fulgt ved hjelp av andre eksperimentelle mannlige typer derved letter indirekte sammenligning av konkurranseevne sperm sine gjennom en felles referanse. Fraksjonen av individer far av de eksperimentelle og referanse menn er identifisert ved hjelp av markører, noe som tillater en å anslå sperm konkurranseevne ved hjelp av enkle matematiske uttrykk ^7,8. I tillegg kan sperm konkurranseevne anslås i to forskjellige scenarier avhengig av om den eksperimentelle mann er andre eller første til å mate (angrep og forsvar analysen, henholdsvis) ^9, som antas å være representative for ulike kompetanse attributter.

Her beskriver vi en tilnærming som bidrar til å avhøre den rollen ulike genetiske faktorer som putatively ligger til grunn than fenomenet sperm konkurransekraft i D. melanogaster.

Introduction

Siden Geoff Parker bemerket utbredelsen av sperm konkurranse i insekter og dets evolusjonære konsekvenser ^to, har en bølge av studier i Drosophila og andre arter forsøkt å kaste lys over dette fenomenet på mange ulike nivåer. Noen eksempler på områder av interesse har vært kartlegging av variasjonen sin i naturlige populasjoner ^9,10, dens genetiske arkitektur og relevansen av underliggende genetiske faktorer ^11-14, og dens rolle i å drive coevolution mellom kjønnene ^15,16. I D. melanogaster kvinner, den begrensede kapasiteten til de spesialiserte sperm-lagring organer, et par spermatheca og banebrytende mottaket ^6,17, bidrar til konkurransen av sperm fra forskjellige menn. Omtrent 1500 sperm overføres under paring til den kvinnelige, men bare ~ 500 kan bli innkvartert i de nevnte organer ^18,19. I laboratoriet, kontrollert dobbelt-parring erfaringmenter som involverer en referanse mannlig og en eller flere hanner av interesse har vært mye brukt for å vurdere sperm konkurransekraft ^7,8.

Sperm konkurranseevne beregnes som andel av avkom avlet av den eksperimentelle mann i dobbel-parring eksperimenter over total avkom, det vil si at fra både eksperimentelle og referanse hanner. Spermolje konkurranseevne består av to komponenter, hver av dem undersøkt i en separat analyse. I handling assay, evnen av den eksperimentelle mannlige sæd for å fortrenge spermier fra det første male, dvs. referansen hann, blir evaluert. Omvendt, i forsvaret analysen, til evnen hos den eksperimentelle mannlige sæd motstå forskyvning, eller for å redusere befruktning suksess av referansen mannlige sæd blir evaluert. Avhengig av hvilken type analyse, forsvar eller krenkelser, er sperm konkurransekraft anslått gjennom resultatet P ₁ eller ₂ P, henholdsvis. P₁ og P ₂ kan bare ta verdier mellom 0 og 1. Mellomliggende verdier er vanligvis tolkes som indirekte bevis på sperm miksing, noe som antyder en fysiologisk scenario som involverer direkte sperm konkurranse. Etter samme begrunnelsen, kan ekstreme verdier tolkes som bevis for sterk differensial sperm konkurranseevne. Tidlige studier viste at P ₂ i D. melanogaster er over 0,8 øker ettersom tiden har gått mellom de to parringer forlenger ^7. Denne samme eksperimentell design har vært brukt i andre Drosophila arter, P ₂ er den vanlige statistikken i studier for å evaluere sperm konkurransekraft ^20. For de fleste arter, er P _세스 verdier av påkjenningen testet høyere enn 0,6 ^21. Likevel kan flere andre mekanismer som ikke er relatert til direkte konkurranse mellom sperm forskjellige hanner gi identiske score (se diskusjon).

Distinguishing avkom sired av den første eller andre hanner er mulig ved bruk av lett identifiserbare markører. I tidlige studier, ble en av hannene bestrålt ved sublethal doser, for eksempel røntgen slik at nesten all ova befruktet av bestrålt sperm ikke klarte å klekke ^7. Senere har mutasjoner forandre øye pigmentering eller vingeformen vært de mest brukte markører. Eksempler på det tidligere er mutasjoner kroppsvekt (brun) ^9, cn (sinober) ²² og w (hvit) ^23, mens mutasjon Cy (Curly) ²⁴ tilsvarer den andre typen fenotyper, og noen av disse mutasjonene har blitt kombinert i samme individ, for eksempel cn kroppsvekt. I mindre grad har allozymes ²⁵ og mikrosatellitter ^26,27 med kjente arv mønstre også blitt brukt.

Den eksperimentelle design for å teste for forskjeller isperm konkurranseevne beskrevet her følger i hovedsak at av Clark et al. ^9. Resultatene stammer fra disse eksperimentene gi opplysninger utelukkende om differensial farskap av de eksperimentelle mannlige typer som granskes. Analyser som også ta høyde for post-befruktning forskjeller i fitness ^14,28 og sperm visualiseringsteknikker ²⁴ aktiver forskjeller i P ₁ (eller P ₂₎ score for å tolkes som forskjeller i sperm kompetanse.

Figur 1 skisserer begrunnelsen for både krenkelser og forsvaret analyser. For å illustrere logistikken av prosessen, gjennomførte et lovbrudd eksperiment i D. melanogaster ¹⁴ vil bli forklart i detalj. Dette bestemte lovbruddet analysen ble brukt til å teste for en målbar effekt av multigene familien Sperm-spesifikk dynein mellomliggende kjeden (Sdic) på sperm konkurranseevne. All medlems av denne multigene familien bor i tandem på X-kromosomet. Knockout hanner ble generert ved å slette Sdic klyngen. Fordi slettet segmentet også inkludert de essensielle genet kort fløyen (SW) og formålet med undersøkelsen var å vurdere relevansen av Sdic, ble menn som bærer Sdic-sw sletting reddet av en transgen kopi av sw (symbolisert som P {sw} , som også bar en mini-hvit reportergen) på kromosom 2. Øye farge ble brukt som en synlig markør for paternity identifikasjon. Alle fluene var i en hvit bakgrunn mutant med unntak av de fra belastningen Oregon-R, som ble anvendt som referanse hanner.

Protocol

Småskalaforsøk bør utføres for å bli kjent med hele prosedyren. En. Samle Virgin Kvinner og naiv Hanner Den enkleste versjonen av den skisserte eksperimentet består av fire typer innledende kors, som innebærer følgende kombinasjon av voksne: a) w 1118 enkeltpersoner for å samle jomfruelige kvinner, b) Oregon-R enkeltpersoner for å samle naive referanse menn, c ) P {sw} homozygote menn og jomfruelige kvinner fra en kontroll lin…

Representative Results

Tabell 2 oppsummerer noen fremtredende trekk ved to krenkelser eksperimenter (Analyser 1 og 2) i hvilken D. melanogaster eksperimentelle hanner med og uten (type I og II, henholdsvis) et funksjonelt Sdic klynge sammenlignes 14.. Etter å ha tatt hensyn til ulike hendelser oppstår med noen gjentak, ble 58-83% av kvinner funnet å være informativ og derfor farskap tellinger av deres avkom kan brukes for å beregne P 2. Resultater av ikke-parametriske tester var i …

Discussion

Vi har beskrevet den eksperimentelle design for å vurdere forskjeller i det relative bidraget av genetisk distinkt D. melanogaster menn til avkommet i kontrollerte dobbelt-parring eksperimenter ^7,8. Dette er gjort i sammenheng med en genetisk faktor hypotese å påvirke sædcellene konkurranseevne og det har blitt illustrert i anstøt assay selv om en lignende prosedyre gjelder feltet analysen (figur 1). Det eksperimentelle design kan bli endret for å teste andre aspekter av patern…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes