Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Summary

Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten.

Abstract

Zufalls microseed Matrix-Screening (RMM) ist ein Protein, in dem Kristallisationstechnik Impfkristalle zufällige Bildschirme aufgenommen. Durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Kristalle in der metastabilen Zone Phasendiagramm eines Proteins wachsen, werden zusätzliche Kristallisation führt oft erhalten, die Qualität der Kristalle hergestellt werden, können erhöht werden, und eine gute Versorgung der Kristalle für die Datensammlung und Einweichen Experimente ist. Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode zur Risikomanagementmaßnahmen, die entweder im Sitzen Drop oder hängenden Tropfen Dampfdiffusionsexperimente, entweder von Hand oder mit Liquid-Handling-Robotik, in 96-Well-oder 24-Well-Format etabliert Fach angewandt werden können.

Introduction

Aus der erstmaligen Anwendung von Perutz, Kendrew und Mitarbeiter bei der Bestimmung der Strukturen von Hämoglobin und Myoglobin, zu den modernen automatisierten Hochdurchsatz-Rohrleitungen der strukturelle Genomik Konsortien hat makromolekularen Röntgenkristallographie uns einen beispiellosen Einblick in die strukturelle Protein-Welt gewährt . Diese Technik bleibt die weithin für experimentelle Methode, die die direkte Visualisierung von Proteinstrukturen auf atomarer erlaubt oder in der Nähe atomarer Auflösung (dh in der 3.1 Å-Bereich). Eine Voraussetzung für die Röntgenbeugung an ein Protein angewendet werden, ist, dass es zunächst kristallisiert werden, und es ist diese Stufe des Verfahrens, die die größte einzelne geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Strukturaufklärung von Beugungsmethoden ^{1, 2} bleibt. Trotz erheblicher Fortschritte in unserem Verständnis des Prozesses der Proteinkristallisation, und die wichtigsten Verbesserungen in der Qualität und Verfügbarkeit der Kristallisation Bildschirme,Tabletts, und verwandte Technologien bleibt es unmöglich, die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs Kristallisations ³ zuverlässig vorhersagen. Biochemische und biophysikalische Methoden angewendet werden, um zu beurteilen, ob ein Protein von Interesse zeigt günstige Eigenschaften für die Kristallkeimbildung und Wachstum, ist also gut gefaltet, homogen, monodisperse etc. werden jedoch diese Erkenntnisse in keiner Weise eine definitive Prädiktor Kristallisations Neigung.

Seeding ist schon lange behauptet worden, um eine praktikable Methode zur Verbesserung der Anzahl, Größe und Qualität der vorhandenen Kristalle oder kristallines Material ^4-7 sein. Dieser Ansatz basiert auf der Prämisse, dass ein Zustand, der Kristallkeimbildung unterstützt möglicherweise nicht optimal für die anschließende Kristallwachstum und umgekehrt basiert. Durch die Übertragung von kernhaltigen Material von einem Zustand zum anderen, kann man versuchen, diese Prozesse effektiv zu entkoppeln und damit den Zugang zu neuen, noch unerforschten Raum Kristallisation,und als Ergebnis eine Erhöhung der Gesamterfolgsrate eines Screening-Experiment. Etablierte Methoden (i) macroseeding, die Übertragung eines Einkristalls in ihrer Gesamtheit von einem Zustand zu einem anderen ^8, (ii) Animpfen Streifen, die Übertragung von kernhaltigen Material, in der Regel durch die Anwendung von gerichteten Druck unter Verwendung beispielsweise erhalten dokumentiert ein Whisker auf der Oberfläche eines vorhandenen Kristall, gefolgt von der anschließenden Passage des Whiskers mit einem neuen Kristallisationstropfen ^9, und (iii) "klassische" microseeding die Übertragung von Kristall "Keime" von Ernte erzeugten zerkleinerten Kristalle (oder kristallinen Material), in die Bedingungen, ähnlich denen, die den Samen ¹⁰ ergab. Insbesondere alle drei dieser Methoden sind zeitaufwendig und schlecht skalierbar, sicher im Vergleich zu dem, was erreichbar ist mit modernen Liquid Handling Kristallisation Robotik. Diese Faktoren haben dazu beigetragen, auf einer bestimmten Ebene zumindest auf die Wahrnehmung, dass die Saatguting ist eine Methode, um nur besucht, wenn andere Ansätze haben es versäumt, Früchte tragen werden.

Zufallsmatrix microseeding (RMM) ist eine neue methodische Innovation, die die Vorteile der traditionellen microseeding mit denen von Hochdurchsatz-Screening und Skalierbarkeit ^11-13 verbindet. Dieser Ansatz beruht auf der Erzeugung eines Saatgut, aus kernhaltigen kristallinen Materials, die in / auf jeden sub-well/coverslip innerhalb eines Standard-96-Zustand Kristallisation Bildschirm aliquotiert werden können, hergestellt. Dieses Verfahren ist sowohl im Sitzen oder hängenden Tropfen Dampfdiffusionsexperimente, entweder von Hand oder mit Liquid-Handling-Robotik, in 24-Well-oder 96-Well-Format Fach etabliert. RMM wurde experimentell nachgewiesen, dass die Kristallisation Erfolgsquote deutlich zu erhöhen, und produzieren Kristalle von mehr Beugungs Qualität und Quantität ^{11, 13, 14,} und stellt ein innovatives Instrument in der Kristallographen "Arsenal der Ansätze in der oLaufende Anstrengungen zur Kristallisation Erfolg. Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren zur RMM und Probendaten bereitzustellen, die die Wirksamkeit dieser Technik.

Protocol

1. Strategische Überlegungen Die Wahl der Samenkristalle für microseeding Versuchen verwendet werden, je nach dem Ziel des Experiments variieren. Zu Beginn eines Projektes ist es hilfreich, mehrere Kristallisations Hits, die alternative Startpunkte für Kristall-Optimierung bieten kann. RMM reduziert die Notwendigkeit für kristall Optimierung weil gute Qualität Kristalle sind eher in der metastabilen Zone des Phasendiagramms, also in dem Bereich, wo folgende Störung oder Keimbildung kehrt das Sy…

Representative Results

(A) Beispiel für ein Experiment Rmms Um die Wirksamkeit der RMM-Screening zeigen wir diese Methode angewandt, um die Kristallisation von Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL) und Rinderleber-Katalase (BLC). Beide Enzyme sind hervorragend kristallisierbarem und strukturell gut charakterisiert Ziele 15, 16. Als solche bieten beide ausgezeichnete Testpersonen, mit denen die Erfolgsquote verbesserte Kristallisations erreichbar mit RMM illustrieren. Es wurden Experimente in 96-Well-Sitting Drop …

Discussion

In diesem Papier haben wir eine allgemeine Methode zur Proteinkristallisation Rmms Screening beschrieben. Wir haben mit zwei Testproteine ​​eine signifikante Verbesserung bei der Kristallisation Erfolgsrate dieser Methode demonstriert. Beugungsanalyse mit Synchrotronstrahlung einer Teilmenge der Kristalle, die unter Verwendung RMM und nicht-Rmms Methoden zeigte wenig Veränderung in der Qualität zwischen Beugungs Kristalle gewachsen mit beiden Methoden, obwohl früheren Autoren haben berichtet, dass gute Qualität …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Phoenix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0