Att förbättra andelen framgångsrika Protein Kristallisering av Random Microseed Matrix Screening

Summary

Här beskriver vi en generell metod för slump microseed matrisscreening. Denna teknik har visat sig signifikant öka andelen framgångsrika proteinkristallisescreeningexperiment, minska behovet av optimering, och ge en tillförlitlig leverans av kristaller för datainsamling och ligand-blötläggningsförsök.

Abstract

Slumpmässig microseed matris screening (RMM) är ett protein kristal teknik där ympkristaller sättes till slumpmässiga skärmar. Genom att öka sannolikheten för att kristallerna kommer att växa i den metastabila zonen av ett proteins fasdiagram, är extra kristallisa leder ofta erhållits, kvaliteten på kristaller som produceras kan ökas, och ett bra utbud av kristaller för datainsamling och blötläggningsförsök tillhandahålls. Här beskriver vi en generell metod för riskhanteringsåtgärder som kan tillämpas på antingen sittande droppe eller hängande droppångdiffusion experiment som fastställs antingen för hand eller med hjälp av flytande robothantering i 96-brunn eller 24-brunnar format.

Introduction

Från sin ursprungliga ansökan genom Perutz, Kendrew och medarbetare i att bestämma strukturerna för hemoglobin och myoglobin, till de moderna med hög genomströmning automatiserade rörledningar av Structural Genomics konsortier har makromolekylär röntgenkristallografi gav oss en enorm strukturell inblick i protein världen . Denna teknik är fortfarande den mest tillämplig experimentell metod som tillåter direkt visualisering av proteinstrukturen på atomär eller nära atomär upplösning (dvs. inom 1-3 en rad). En förutsättning för röntgendiffraktion som skall tillämpas på ett protein är att det först måste kristalliseras, och det är detta skede av processen som förblir den största enskilda hastighetsbegränsande steget i strukturbestämning genom diffraktion metoderna ^{1, 2.} Trots betydande framsteg i vår förståelse av processen för proteinkristallisering, och stora förbättringar av kvaliteten och tillgången på kristallisa skärmar,korgar och relaterad teknik, är det fortfarande omöjligt att tillförlitligt förutsäga sannolikheten för kristallise framgång ^3. Biokemiska och biofysikaliska metoder kan tillämpas för att bedöma om ett protein av intresse visar gynnsamma egenskaper för kristallkärnbildning och tillväxt, är dvs det väl-vikas, homogen, monodispersa, etc, men dessa insikter inte på något sätt ge en definitiv prediktor för kristallisering benägenhet.

Sådd har länge påstods vara en genomförbar metod för att förbättra antal, storlek och kvalitet av befintliga kristaller eller kristallint material ^4-7. Denna metod bygger på antagandet att ett tillstånd som stöder kristall kärnbildning kanske inte optimalt för efterföljande kristalltillväxt och vice versa. Genom att överföra kärnmaterial från ett tillstånd till ett annat, kan man försöka att effektivt frikoppla dessa processer, vilket ger tillgång till nya, ännu outforskade kristallise utrymme,och som ett resultat ökar den totala framgång på en screening experiment. Etablerade metoder har dokumenterats för (i) macroseeding, överföring av en enkristall i sin helhet från ett tillstånd till ett annat ^8, (ii) strimma seeding, överföring av kärnförsedda material, i allmänhet erhållas genom tillämpning av riktad tryck med användning av till exempel en katts morrhår till ytan av en existerande kristaller, följt av efterföljande passagen av whisker genom ett nytt kristallisa droppe ^9, och (iii) "klassiska" microseeding, överföring av kristall "frön", som genereras av skörd krossade kristaller (eller kristallint material), in i betingelser som liknar de som gav fröna ^10. Särskilt alla tre av dessa metoder är tidskrävande och dåligt skalbara, särskilt i jämförelse med vad som är möjligt med moderna vätskehanteringskristallise robotik. Dessa faktorer har bidragit, på någon nivå åtminstone, till uppfattningen att utsädening är en metod som endast besökas när andra metoder har misslyckats med att ge resultat.

Slumpmässig matris microseeding (RMMS) är en ny metodologisk innovation som kombinerar fördelarna med traditionell microseeding med de av höghastighetsscreening och skalbarhet ^11-13. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på alstring av en startkultur, som tillverkas av kärnförsedda kristallina materialet, vilket kan alikvoteras i / på varje sub-well/coverslip i en standard 96-condition kristal skärmen. Denna metod är tillämplig på både sittande eller hängande droppångdiffusion experiment som fastställs antingen för hand eller med hjälp av flytande robothantering i 24-brunn eller 96-brunnar format. riskhanteringsåtgärder har visats experimentellt att avsevärt öka kristallise framgång, och producera kristaller av större diffraktion kvalitet och kvantitet ^{11, 13, 14,} och utgör ett innovativt verktyg i kristallo "arsenal av metoder i oNgoing insats för kristallise framgång. Här beskriver vi en generell metod för RMM och ger exempeldata som visar effektiviteten av denna teknik.

Protocol

1. Strategiska överväganden Valet av frö-kristaller som används för microseeding experiment kommer att variera beroende på syftet med försöket. I början av ett projekt är det bra att hitta flera kristallisa hits som kan ge alternativa utgångspunkter för kristalloptimering. riskhanteringsåtgärder minskar avsevärt behovet av kristall optimering eftersom god kvalitet kristaller är mer sannolikt att växa i den metastabila zonen av fasdiagram, dvs i det område där följande störningar …

Representative Results

(A) Exempel på en RMM experiment För att demonstrera effektiviteten av RMM screening vi tillämpat denna metod för att kristallisationen av höna äggvitelysozym (HEWL) och bovin lever katalas (BLC). Båda dessa enzymer är synnerligen kristalliserbar och är strukturellt väl karakteriserade målen 15, 16. Som sådan båda ger utmärkt försökspersoner med för att illustrera den förbättrade kristal framgång uppnås med riskhanteringsåtgärder. Kristallisaexperiment etablera…

Discussion

I denna skrift har vi beskrivit ett allmänt förfarande för RMM proteinkristallisascreening. Vi har visat genom att använda två testproteiner en betydande förbättring i kristallise framgång med denna metod. Diffraktion analys med synkrotronljus av en delmängd av kristaller som genereras med hjälp av riskhanteringsåtgärder och icke-RMMS metoder visade liten variation i diffraktion kvalitet mellan kristaller odlas antingen metod, även om tidigare författare har rapporterat att god kvalitet kristaller är mer …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Phoenix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0