موت الخلايا المرتبطة الانقسام الشاذ التي لاحظها التصوير متحد البؤر في الخلايا السرطانية لايف
Summary
وقد تم توثيق النشاط السامة للخلايا من phenanthridine PJ-34 في خلايا السرطان الذين يخضعون الانقسام في الوقت الحقيقي من خلال التصوير متحد البؤر الحية. PJ-34 استئصال سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 الخلايا إيواء خارج centrosomes في الانقسام. على عكس الانقسام ثنائي الوصل العادي، لم تكن متفاوتة المسافات خارج centrosomes في قطبي المغزل في حضور PJ-34.
Abstract
المشتقات فينانثرين بوصفها قوية PARP1 مثبطات تحول دون تجميع ثنائي الوصل من centrosomes الزائدين في خلايا متعددة centrosomal السرطانية البشرية في الانقسام. كان phenanthridine PJ-34 جزيء أقوى. Declustering من خارج centrosomes أسباب فشل الإنقسامية وموت الخلايا في الخلايا المتعددة centrosomal. معظم السرطانات البشرية الصلبة لديها حدوث ارتفاع إضافي، centrosomes. وقد تم توثيق هذا النشاط من PJ-34 في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير متحد البؤر الحية سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 الخلايا transfected مع ناقلات ترميز لفلوري γ-تويولين، وهي وفيرة للغاية في centrosomes والفلورسنت H2B هيستون في الوقت الحاضر الكروموسومات. تم الكشف عن ترتيبات الكروموسومات الشاذة ودي عنقودية بؤر γ-تويولين تمثل centrosomes declustered في transfected MDA-MB-231 الخلايا بعد العلاج مع PJ-34. الأمم المتحدة عنقودية خارج centrosomes في قطبي المغزل سبقت موت الخلية الخاصة بهم. هذه النتائج مرتبطة FOR للمرة الأولى في النشاط السامة للخلايا الحصري الكشف مؤخرا من PJ-34 في الخلايا السرطانية البشرية مع خارج centrosomes دو المجموعات في الانقسام، وفشل الإنقسامية مما يؤدي إلى موت الخلية. ووفقا لنتائج الدراسة السابقة التي لاحظها التصوير متحد البؤر الخلايا الثابتة، PJ-34 الخلايا السرطانية القضاء حصرا مع متعددة centrosomes دون المساس تمر الخلايا الطبيعية الانقسام مع اثنين من centrosomes ومغزل ثنائي الوصل. لم يشارك هذا النشاط السامة للخلايا من PJ-34 بواسطة أخرى قوية PARP1 مثبطات، ولوحظ في PARP1 ناقصة MEF extracentrosomes إيواء، مما يشير إلى الاستقلالية لها من PARP1 تثبيط. يعيش التصوير متحد البؤر عرضت أداة مفيدة لتحديد جزيئات جديدة القضاء على الخلايا أثناء الانقسام.
Introduction
المستمدة فينانثرين PARP1 مثبطات، بما في ذلك PJ-34، وقد صممت لحماية الخلايا هادئة من موت الخلايا أفكارك الناجمة عن الطاقة المستهلكة PARP1 بوساطة الحمض النووي إصلاح تحت ظروف الإجهاد (احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية) 1. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة اكتشفنا أن PJ-34، في تركيز أعلى مرتين من أن يحفز PARP1 تثبيط، يمكن أن يسبب موت الخلايا حصرا في الخلايا السرطانية البشرية 2،3. كان أكثر سرعة انتشار الخلية، وكان أكثر كفاءة في القضاء على الخلايا. ويعزى النشاط السامة للخلايا من PJ-34 إلى خارج centrosomes دو المجموعات في الانقسام 2. العديد من الخلايا السرطانية البشرية الميناء multicentrosomes 4،5. الحضانة من الخلايا البشرية سرطان الثدي MDA-MB-231، التي تؤوي centrosomes الزائدين، مع 20 ميكرومتر PJ-34 استئصاله كفاءة هذه الخلايا في غضون 72-96 ساعة دون إضعاف الخلايا هادئة أو بعض الخلايا المتكاثرة حميدة بايواء اثنين centrosomes في الانقسام <suP> 2،3. تضمين الخلايا حميدة الإنسان خلايا الظهارية الثديية MCF-10، الخلايا البطانية الإنسان (HUVEC) وخلايا اللحمة المتوسطة الأولية المحضرة من الغدة الصعترية الإنسان. وكانت هذه الخلايا مقاومة لهذا النشاط السامة للخلايا من PJ-34. لم PJ-34 لا تتداخل مع دورة الخلية الخاصة بهم خلال 96 ساعة الحضانة أو تؤثر centrosomes وتشكيل المغزل ثنائي الوصل 2،3.
ثنائي القطب الجسيم المركزي الجمعية هو أمر حاسم لتشكيل مغزل الانقسام بين القطبين في 4،5. ولذلك، وضعت الخلايا مع أكثر من عقدين من centrosomes آلية الجزيئية فهم نادرا، تجميع centrosomes بهم إضافية في قطبين 4-9. قد فشل القطبين جمعية centrosomes قضيتهم متعدد الأقطاب مشوهة مغزل والشاذة الكروموسومات الفصل الذي يسيطر على دورة الخلية في G2 / M الاعتقال، ويؤدي إلى موت الخلايا التي تعزى إلى فشل الإنقسامية 4،5. يتم التحقيق بشكل مكثف الآليات الجزيئية الكامنة وراء خارج centrosomes دو المجموعات <سوب> 10. وفهم آلية موت هذا تمكين القضاء حصرية من الخلايا السرطانية في حين أن يجنب الأنسجة 5،10 صحية.
وهكذا، والمركبات التي تستخدم لتنشيط موت الخلايا الإنقسامية كارثة نقدم طريقة جديدة لعلاج السرطان انتقائية، والتي قد تكون فعالة في مجموعة واسعة من النتائج cancers.Our الصلبة الإنسان تشير إلى أن التصوير متحد البؤر يمكن أن تستخدم لتحديد الجزيئات التي تؤثر خارج centrosomes التجميع في الانقسام 2،3، مما يجعل هذه المركبات سرطان استهداف المرشحين المخدرات.
لقد وثقنا النشاط السامة للخلايا من phenanthridine PJ-34 عن طريق المسح الضوئي خلايا سرطانية بشرية ثابتة وحية (مع حدوث ارتفاع إضافي، centrosomes في الانقسام) مقابل الخلايا الطبيعية. ويرد وصف خطوة خطوة من إجراءات التصوير المستخدمة لتحديد النشاط السامة للخلايا من PJ-34 في خلايا سرطانية بشرية أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعيش المقدمة التصوير متحد البؤر وثائق في الوقت الحقيقي من تأثير السامة للخلايا من PJ-34 في خلايا متعددة centrosomal الحية خلال الانقسام (الشكل 3 و معلومات تكميلية). وكان هذا أول الوثائق الحية عازيا السمسة من PJ-34 في خلايا سرطانية بشرية لcentrosomes اضافية دي تجميع وموت الخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مصادر التمويل لهذا البحث: صندوق مشترك لشركة جامعة تل أبيب نقل التكنولوجيا، راموت ومركز سبأ-الطبية (M. CA وSI)، ICRF – سرطان الإسرائيلي البحوث في مؤسسة (M. CA.) ومؤسسة العلوم اسرائيل ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5′-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let’s huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
