Rénale Capsule xénogreffe sous-cutanée et Pellet implantation pour l'évaluation de la carcinogenèse prostatique et l'hyperplasie prostatique bénigne
Summary
Nous décrivons la fabrication de pastilles comprimées d'hormones, ainsi que l'implantation chirurgicale sous-cutanée à des souris. Cette stratégie peut être combinée avec la croissance de xénogreffes de cellules et de tissus sous la capsule rénale de souris nudes athymiques pour évaluer la carcinogenèse hormonale et la régulation de la croissance bénigne de la prostate.
Abstract
Nouvelles thérapies pour les deux maladies courantes de la prostate, le cancer de la prostate (AEPA) et l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP), dépendent de façon critique sur les expériences évaluant leur régulation hormonale. Hormones stéroïdes sexe (notamment les androgènes et oestrogènes) sont importants dans érythroblastopénie et l'HBP; nous sondons leurs rôles respectifs dans l'induction de la croissance de la prostate et la cancérogenèse chez la souris avec des expériences à l'aide de pastilles d'hormones compressés. Hormones et / ou de drogues pastilles sont facilement fabriqués avec une presse à pellets, et chirurgicalement implantés dans le tissu sous-cutané de l'hôte chez les souris mâles. Nous décrivons également un protocole pour l'évaluation de la carcinogenèse hormonale sous-cutanée en combinaison avec l'hormone culot implantation de recombinants xénogreffe de cellules de la prostate sous la capsule rénale de souris immunodéprimées. En outre, l'hormone sous-cutanée culot implantation, en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de tissu de BPH, est utile pour mieux comprendre la régulation hormonale de prost bénignemangé la croissance, et de tester de nouvelles thérapies ciblant sexe stéroïde voies hormonales.
Introduction
Cancer de la prostate (AEPA) et l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) sont des fardeaux pour la santé. L'érythroblastopénie est le deuxième cancer d'organe solide la plus fréquente chez les hommes et une cause majeure de cancer liés mort 1. L'HBP est également très fréquente chez les hommes plus âgés, et il est estimé que la manifestation clinique de l'HBP, la baisse des symptômes des voies urinaires (TUBA), aura une incidence sur 50-90% des hommes 2. Alors que les androgènes et oestrogènes sont connus pour être important dans érythroblastopénie et BPH, notre compréhension des mécanismes hormonaux qui sous-tendent la carcinogenèse et la croissance reste incomplète 3,4. Modèles animaux simples et dociles génétiquement sous-tendent les études qui permettront de répondre à ces priorités dans la recherche de la prostate. Dans hormones maladies sensibles tels que l'érythroblastopénie et l'HBP, l'utilisation de sous-cutanée, la lenteur des pastilles d'hormones de libération, isolément ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe (le transfert de cellules, de tissus ou d'organes d'une espèce à une autre) dans le immunocompSouris hôte romised, fournit un procédé simple et reproductible pour l'étude de la régulation hormonale de la croissance et de la cancérogenèse.
Sous-cutanée hormone culot implantation est une technique simple et reproductible pour étudier la régulation hormonale de la carcinogenèse et la croissance bénigne de la prostate 5. Implantation sous-cutanée de souris mâles adultes avec 25 mg de testosterone (T) et 2,5 mg de 17β-estradiol (E 2), provoque une augmentation dans le sérum E 2 et diminution progressive de la T, de recréer l'environnement hormonal dynamique de l'homme vieillissant 5,6. En outre, ce modèle reprend la plupart des caractéristiques cliniques de l'HBP-TUBA 5,7. D'autres méthodes d'administration d'hormones comprennent l'administration orale / de gavage ou par injection intrapéritonéale, qui causent une détresse à l'rongeur, sont moins cohérentes dans la prestation de la même quantité de médicament dans le temps, et sont plus de main-d'œuvre d'une implantation chirurgicale d'un temps. D'autres modes de sous-cutanées hormone et / ou l'administration de médicaments comprennent les capsules de Silastic 8. Alors que nous avons aussi l'expérience avec l'utilisation de capsules de Silastic, granulés compressés sont favorisés pour leur facilité d'utilisation et la reproductibilité. En outre, les taux de pastilles d'hormones comprimé à libération mieux imiter les rapports dynamiques sexuelles stéroïdes hormonaux observés chez les hommes vieillissants 5,7.
Depuis le développement des souris génétiquement immunodéprimé, de nombreux systèmes de modèle in vivo en incorporant des techniques de la xénogreffe ont été mis au point pour l'étude d'une grande variété de tissus normaux et malades. Il existe plusieurs catégories de base de la xénogreffe. xénogreffes de tissus sont constitués d'un petit morceau de tissu intact, ce qui peut être une structure normale, une tumeur maligne ou bénigne croissance. Szot et al. (2007) ont récemment éclairé rénale capsule xénogreffe d'îlots pancréatiques 9. Aamdal et al. (1985) a décrit la capsule rénale xénogreffe de 27 lignées cellulaires de cancer humain en imsouris munocompromised accueille 10. Greffons peuvent aussi être composés d'une seule lignée cellulaire immortalisée (cancéreuse ou non tumorigènes), ou peuvent être constitués d'une lignée cellulaire immortalisée combiné avec des cellules isolées à partir de mésenchyme (greffe de cellules recombinantes).
Nous privilégions la xénogreffe de recombinants de cellules de sonder les rôles respectifs de stroma et de l'épithélium dans le développement d'érythroblastopénie et BPH. Cunha et al. (1980) a été le premier à signaler que lorsque les adultes murin épithélium de la vessie est combiné avec embryonnaire mésenchyme urogénital des sinus (UGM) et xénogreffes sous la capsule rénale d'hôtes souris mâles, le tissu se développe en structures ressemblant prostate acini 11. Norman et al. (1986) a montré que la souris adulte prostate canalaire épithélium et UGM, lorsqu'il est combiné à des recombinants de tissus, connaissent une croissance canalaire et la morphogenèse de ramification 12. Hayward et al. (1988) a montré que l'épithélium de la prostate humain répond à inductifs m fœtaleesenchyme de la même façon 13. Un modèle hormonal de la carcinogenèse de la prostate, en combinant la lignée de cellules épithéliales de prostate humaine immortalisée BPH-1 avec UGM, a d'abord été rapporté par Wang et al. 14 (2001) et a été largement utilisé dans notre laboratoire 15. Ce modèle est bien adapté pour la compréhension de la progression érythroblastopénie parce épithélium bénigne de la prostate se transforme en maladie métastatique, la modélisation avancée érythroblastopénie chez l'homme 5. Parce que les composants spécifiques peuvent être manipulées génétiquement, cellule greffe recombinant est particulièrement utile comme une approche pour évaluer les interactions stroma-épithéliales.
Autres sites appropriés pour la xénogreffe sont intradermique, sous-cutanée et lieux orthotopiques 16. Selon le procédé de l'intérêt du tissu et de la maladie, ceux-ci peuvent être d'autres méthodes appropriées. Pour l'étude de la carcinogenèse hormonale de la prostate et de la réglementation de tumeur bénigne, nous choisissons la capsule rénalesite pour xénogreffe en raison de ses supérieurs greffe prenne taux, l'approvisionnement en sang en abondance, et la capacité à implanter un plus grand nombre de xénogreffes dans un seul site confiné 16. De plus, la manipulation hormonale de la souris de l'hôte qui donne lieu à une atrophie de la prostate limite l'utilisation de la prostate greffe orthotopique 16.
Ce protocole définit les techniques de fabrication comprimé hormone / médicament culot et l'implantation chirurgicale, de même que la capsule rénale xénogreffe de greffes de cellules et de tissus de la prostate humaine. Ensemble, ces techniques fournissent un dosage sensible pour déterminer si une souris génétiquement modifiée est plus sensible à l'érythroblastopénie et / ou à la BPH initiation de souches témoins. Xénogreffe est une technique puissante pour l'évaluation in vivo du potentiel des cellules expérimentales pour développer histologique et les caractéristiques moléculaires des tumeurs malignes, ainsi que d'un essai pour de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une large variété de maladies bénignes et malignes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce document et le protocole décrit ici décrivent la fabrication de l'hormone comprimé et / ou granulés de drogue, et la procédure chirurgicale pour sous-cutanée culot implantation de souris. Selon la question de recherche à traiter, cette technique peut être réalisée individuellement ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de cellules de la prostate greffes recombinantes ou des xénogreffes de tissus de la prostate, qui sont des techniques largement utilisées dans la recherche de la prostate <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Ricke, passés et présents. Nous remercions Calvin Patten, Jr., DVM et Brigitte Raabe, DVM, des commentaires utiles sur le protocole. Nous tenons à remercier le NIDDK, NCI, et NIEHS pour leur soutien financier pour ces études: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN est un stagiaire dans le Programme de formation scientifique médicale à l'Université de Rochester financé par le NIH GM07356 T32, le NIH sous Ruth L. Kirschstein Prix national F30DK093173 Service de recherche soutient également ce projet. CDV est soutenu par T32CA157322 et ABT est soutenu par T32ES007015 à l'Université de Wisconsin-Madison. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national des sciences médicales générales ou NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
References
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
