Renale Capsule xenotrapianto e sottocutanea Pellet impianto per la valutazione di carcinogenesi della prostata e dell'iperplasia prostatica benigna
Summary
Descriviamo la fabbricazione di pellet ormonali compressi, nonché sottocutanea impianto chirurgico in topi. Questa strategia può essere combinato con la crescita di cellule e tessuti xenotrapianti sotto la capsula renale di topi nudi atimici valutare cancerogenesi ormonale e regolazione della crescita prostatica benigna.
Abstract
Nuove terapie per due malattie comuni della prostata, il cancro alla prostata (PRCA) e iperplasia prostatica benigna (BPH), dipendono in modo critico sugli esperimenti che valutano la loro regolazione ormonale. Ormoni sessuali steroidei (in particolare androgeni ed estrogeni) sono importanti in PRCA e BPH, si sonda i loro rispettivi ruoli nell'indurre la crescita della prostata e carcinogenesi in topi con esperimenti usando pellet ormonali compressi. Ormonali e / o droga pellet sono facilmente realizzati con una pressa pellet, e chirurgicamente impiantati nel tessuto sottocutaneo dell'host topo maschio. Noi descriviamo anche un protocollo per la valutazione della carcinogenesi ormonale combinando sottocutanea dell'ormone pellet impianto con xenotrapianto di cellule ricombinanti prostata sotto la capsula renale di topi immunocompromessi. Inoltre, l'ormone sottocutanea pellet impianto, in combinazione con la capsula renale xenotrapianto di tessuto di BPH, è utile per capire meglio regolazione ormonale del prost benignamangiato la crescita, e per testare nuove terapie mirate sesso steroidi percorsi ormonali.
Introduction
Il cancro della prostata (PRCA) e iperplasia prostatica benigna (BPH) sono significativi oneri sanitari. PRCA è il secondo tumore solido più frequente negli uomini ed una delle principali cause di cancro legate morte 1. BPH è anche molto diffusa tra gli uomini più anziani, e si stima che la manifestazione clinica di BPH, sintomi delle basse vie urinarie (LUTS), interesserà 50-90% degli uomini 2. Mentre androgeni ed estrogeni sono noti per essere importanti in PRCA e BPH, la nostra comprensione dei meccanismi ormonali che sono alla base della carcinogenesi e la crescita rimane incompleto 3,4. Modelli animali semplici e geneticamente trattabili sono alla base degli studi che affronteranno tali priorità nella ricerca della prostata. In ormonali malattie reattive come PRCA e BPH, l'uso del sottocutaneo, pellets ormone di rilascio lento, isolatamente o in combinazione con capsula renale xenotrapianto (il trasferimento di cellule, tessuti o organi da una specie all'altra) nel immunocompospite del mouse romised, fornisce un metodo semplice e riproducibile per lo studio regolazione ormonale della crescita e carcinogenesi.
Sottocutanea ormone pellet impianto è una tecnica semplice e riproducibile per studiare regolazione ormonale della carcinogenesi e formazione benigna della prostata 5. Impianto sottocutaneo di topi maschi adulti con 25 mg di testosterone (T) e 2,5 mg di 17β-estradiolo (E2), causa un aumento nel siero E 2 e graduale diminuzione della T, ricreando l'ambiente ormonale dinamico di uomini di invecchiamento 5,6. Inoltre, questo modello riassume molte delle caratteristiche cliniche di BPH-LUTS 5,7. Metodi alternativi di somministrazione di ormoni comprendono la somministrazione orale / sonda gastrica o iniezione intraperitoneale, che causare disagio al roditore, sono meno consistenti nel fornire la stessa quantità di farmaco nel tempo, e sono più di un impianto chirurgico di una volta intensità di lavoro. Altri modi sottocutanei per hOrmone e / o la somministrazione di farmaci includono capsule Silastic 8. Mentre abbiamo anche l'esperienza con l'utilizzo di capsule Silastic, pellets compressi sono favoriti per la loro facilità d'uso e riproducibilità. Inoltre, i tassi di rilascio di pellet ormonali compressi meglio imitano gli ormoni steroidei sessuali rapporti dinamici osservati in uomini di invecchiamento 5,7.
Poiché lo sviluppo di topi geneticamente immunocompromessi, numerosi sistemi modello in vivo dotati di tecniche xenotrapianto sono stati sviluppati per lo studio di una ampia varietà di tessuti normali e malati. Ci sono diverse categorie di base di xenotrapianto. Xenotrapianti tessuti costituiti da un piccolo pezzo di tessuto intatto, che può essere una struttura normale, tumore maligno, o formazione benigna. Szot et al. (2007) hanno recentemente illuminato capsula renale xenotrapianto di insule pancreatiche 9. Aamdal et al. (1985) ha descritto capsula renale xenotrapianto di 27 linee cellulari tumorali umane in imMouse munocompromised ospita 10. Innesti possono anche essere costituiti da una singola linea di cellule immortalizzate (cancerose o non-oncogeno), o possono essere costituiti da una linea di cellule immortalizzate combinata con cellule isolate dal mesenchima (cella innesto ricombinante).
Siamo favorevoli xenotrapianto di cellule ricombinanti per sondare i rispettivi ruoli di stroma ed epitelio nello sviluppo di PRCA e BPH. Cunha et al. (1980) fu il primo a riferire che quando adulto murino epitelio della vescica è combinato con mesenchima embrionale urogenitale sinusale (UGM) e eterotrapiantate sotto la capsula renale di topi maschi padroni di casa, il tessuto si sviluppa in strutture che assomigliano alla prostata acini 11. Norman et al. (1986) ha mostrato che topo adulto prostatica duttale e UGM, se combinati in ricombinanti tessuti, subiscono la crescita duttale e la ramificazione morfogenesi 12. Hayward et al. (1988) ha mostrato che epitelio prostatico umano risponde induttivo m fetaleesenchyme in modo simile 13. Un modello ormonale della carcinogenesi della prostata, combinando la prostata umana immortalizzate linea cellulare epiteliale BPH-1 con UGM, è stata riportata da Wang et al. 14 (2001) ed è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio 15. Questo modello è adatto per comprendere PRCA progressione perché benigna dell'epitelio prostatico si trasforma in malattia metastatica, modellazione avanzata PRCA negli esseri umani 5. Poiché i componenti specifici possono essere geneticamente manipolati, cellule innesto ricombinante è particolarmente utile come approccio per valutare le interazioni stroma-epiteliale.
Altri siti idonei per xenotrapianto sono intradermica, sottocutanea e luoghi ortotopici 16. A seconda del processo di tessuto e la malattia di interesse, questi possono essere approcci alternativi adatti. Per lo studio di carcinogenesi della prostata ormonale e regolazione della crescita benigna, scegliamo la capsula renalesito per xenotrapianto grazie alle sue innesto superiori prendere velocità, abbondante afflusso di sangue, e la capacità di impiantare un numero maggiore di xenotrapianti in un sito limitato a 16. Inoltre, la manipolazione ormonale del mouse host che provoca atrofia prostatica limita l'uso della prostata ortotopico innesto 16.
Questo protocollo descrive le tecniche di produzione dell'ormone compressa / droga pellet e impianto chirurgico, così come capsula renale xenotrapianto di cellule della prostata e tessuti umani innesti. Insieme, queste tecniche forniscono un saggio sensibile per determinare se un topo geneticamente modificato è più suscettibile di PRCA e / o BPH iniziazione di ceppi di controllo. Xenotrapianto è una tecnica potente per la valutazione in vivo del potenziale delle cellule sperimentali per sviluppare istologiche e molecolari di malignità, nonché un saggio per strategie di trattamento innovativi per una vasta gamma di malattie benigne e maligne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento e il protocollo descritto nel presente documento descrivono la produzione di ormone compressa e / o pellets droga, e la procedura chirurgica per l'impianto sottocutaneo pellet di topi. A seconda della domanda di ricerca da affrontare, questa tecnica può essere eseguita singolarmente, o in combinazione con capsula renale xenotrapianto di cellule della prostata innesti ricombinanti o xenotrapianti tessuto della prostata, che sono tecniche ampiamente utilizzate nella ricerca prostata 17-19.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Ricke, passati e presenti. Ringraziamo Calvin Patten, Jr., DVM e Brigitte Raabe, DVM, per i commenti utili per quanto riguarda il protocollo. Vorremmo riconoscere il NIDDK, NCI, e NIEHS per il loro sostegno finanziario per questi studi: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN è un tirocinante nel Programma di Formazione Medica Scientist presso l'Università di Rochester finanziato dal NIH T32 GM07356, il NIH sotto Ruth L. Kirschstein Nazionale Research Service Award F30DK093173 supporta anche questo progetto. CDV è supportato da T32CA157322 e ABT è supportato dal T32ES007015 presso l'Università del Wisconsin-Madison. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiali dell'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali o NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
References
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
