Nedsatt Capsule Xenografting og Subkutan Pellet Implantasjon for bedømmelse av Prostata Karsinogenese og benign prostatahyperplasi
Summary
Vi beskriver fremstillingen av komprimerte hormon pellets, samt subkutan kirurgisk implantering i mus. Denne strategi kan kombineres med veksten av celler og vev xenografts under nedsatt kapsel av atymiske nakne mus for å evaluere hormonell karsinogenese og regulering av godartet prostatavekst.
Abstract
Nye behandlingsformer for to vanlige prostatasykdommer, prostatakreft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH), er kritisk avhengige eksperimenter evaluere deres hormonelle regulering. Sex steroidhormoner (spesielt androgener og østrogener) er viktig i PRCA og BPH, vi sondere sine respektive roller i indusere prostata vekst og karsinogenese hos mus med eksperimenter ved hjelp av komprimert hormon pellets. Hormon og / eller narkotika pellets er lett produseres med en pellet press, og implantert i det subkutane vevet av den mannlige mus vert. Vi beskriver også en protokoll for evaluering av hormonelle carcinogenesis ved å kombinere subkutan hormon pellet implantasjon med xenografting av prostata celle rekombinantar under nedsatt kapsel av immunsupprimerte mus. Videre subkutan hormon pellet implantering, i kombinasjon med nedsatt kapsel xenografting av BPH vev, er nyttig for å få en bedre forståelse hormonell regulering av godartet prostspiste vekst, og for å teste ut nye behandlingsformer rettet mot sex steroid hormon trasé.
Introduction
Prostatakreft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH) er betydelige helsemessige byrder. PRCA er den nest mest utbredte solid organ kreft hos menn og en ledende årsak til kreft dødsfall ett. BPH er også svært utbredt blant eldre menn, og det er anslått at den kliniske manifestasjon av BPH, nedre urinveissymptomer (LUTS), vil påvirke 50-90% av mennene to. Mens androgener og østrogener er kjent for å være viktig i PRCA og BPH, vår forståelse av de hormonelle mekanismer som ligger til grunn karsinogenese og veksten er fortsatt ufullstendig 3,4. Enkle og genetisk medgjørlig dyremodeller underbygge de studiene som vil løse disse prioriteringene i prostata forskning. I hormon responsive sykdommer som Erytroaplasi og BPH, bruk av subkutan, langsom frigjøring hormon pellets, alene eller i kombinasjon med nedsatt kapsel xenografting (overføring av celler, vev eller organer fra en art til en annen) inn i immunocompromised mus vert, gir en enkel og reproduserbar fremgangsmåte for å studere hormonelle regulering av vekst og carcinogenese.
Subkutan hormon pellet implantering er en enkel og reproduserbar teknikk for å studere hormonell regulering av karsinogenese og godartet prostata vekst i 5. Subkutan implantasjon av voksne mannlige mus med 25 mg testosteron (T) og 2,5 mg 17β-østradiol (E 2), fører til en økning i serum E 2 og gradvis reduksjon i T, gjenskape den dynamiske hormonelle miljøet i aldrende menn 5,6. I tillegg sammenfatter denne modellen mange av de kliniske symptomene på BPH-LUTS 5,7. Alternative metoder for hormon administrering inkluderer oral / gavage administrering eller intraperitoneal injeksjon, noe som forårsaker ubehag for gnagere, er mindre konsistent i å levere den samme mengde av medikament over tid, og er mer arbeidskrevende enn en engangs kirurgisk implantering. Andre subkutane moduser for hormone og / eller levering av legemidler omfatter Silastic kapsler åtte. Mens vi har også erfaring med bruk av Silastic kapsler, er komprimert pellets favoriserte for sin brukervennlighet og reproduserbarhet. Videre utslippsrater på komprimert hormon pellets bedre etterligne de dynamiske sex steroid hormon intervallene som observeres i aldring menn 5,7.
Siden utviklingen av genetisk immunkompromitterte mus, har tallrike in vivo-modellsystemer som omfatter xenografting teknikker blitt utviklet for studiet av en rekke normale og syke vev. Det er flere grunnleggende kategorier av xenografting. Tissue xenografts består av et lite stykke av intakt vev, som kan være en vanlig struktur, ondartet tumor, eller godartet vekst. Szot et al. (2007) har nylig opplyst nedsatt kapsel xenografting av bukspyttkjertelen holmer ni. Aamdal et al. (1985) beskrev nedsatt kapsel xenografting av 27 menneske kreftcellelinjer i immunocompromised mus vert 10. Grafts kan også være sammensatt av en eneste udødeliggjort cellelinje (kreft eller ikke-tumorigen), eller kan bestå av en udødeliggjort cellelinje kombinert med celler isolert fra mesenchyme (celle rekombinant graft).
Vi favorisere xenografting av celle rekombinantar å sondere de respektive rollene til stroma og epitel i utviklingen av PRCA og BPH. Cunha et al. (1980) var den første til å rapportere at når voksen murine blære epitel er kombinert med embryonale urogenitale sinus mesenchyme (UGM) og xenografted under nedsatt kapsel av hannmus verter, utvikler vevet inn i strukturer som ligner prostata acini 11. Norman et al. (1986) viste at voksne mus prostata ductal epitel og UGM, når kombinert i vev rekombinantar, gjennomgå ductal vekst og forgrening morphogenesis 12. Hayward et al. (1988) viste at menneskelig prostata epitel reagerer på Induktive foster mesenchyme på en lignende måte 13. En hormonell modell av karsinogenese i prostata, ved å kombinere den udødeliggjort human prostata epitelisk cellelinje BPH-en med UGM, ble først rapportert av Wang et al. 14. (2001) og har vært brukt i stor utstrekning i vårt laboratorium 15.. Denne modellen er godt egnet for å forstå PRCA progresjon fordi benign prostatahyperplasi epitel forvandles til metastatisk sykdom, modellering avansert PRCA hos mennesker fem. Fordi enkelte komponenter kan være genetisk manipulert, er spesielt nyttig som en metode for å evaluere stromal-epitelial celle interaksjoner rekombinant poding.
Andre områder egnet for xenografting er intradermal, subkutan og ortotopiske steder 16. Avhengig av vev og sykdomsprosessen av interesse, kan disse være egnede alternative tilnærminger. For studiet av prostata hormonell karsinogenese og godartet vekst regulering, velger vi den nyre kapselstedet for xenografting på grunn av sin høyere pode ta sats, rikelig blodtilførsel, og evne til å implantere et større antall xenografts til ett begrenset område 16. Videre begrenser hormonell manipulering av verts mus som resulterer i prostata atrofi bruk av prostata orthotopic poding 16..
Denne protokollen beskriver teknikker for komprimert hormon / medikament pellet fremstilling og kirurgisk implantering, så vel som nedsatt kapsel xenografting av human prostataceller og vev grafts. Sammen utgjør disse teknikkene gir en følsom analyse for å bestemme om en genetisk modifiserte mus er mer utsatt for Erytroaplasi og / eller BPH initiering enn kontrollstammer. Xenografting er en kraftfull teknikk for in vivo-evaluering av potensialet for eksperimentelle celler til å utvikle histologisk og molekylære trekk ved ondartet sykdom, så vel som et assay for nye behandlingsstrategier for et bredt utvalg av godartede og ondartede sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papiret og protokollen beskrevet heri beskriver fremstillingen av komprimerte hormon-og / eller medikament pellets, og den kirurgiske prosedyre for subkutan implantasjon pellet av mus. Avhengig av problemstillingen tas opp, kan denne teknikken utføres enkeltvis eller i kombinasjon med nedsatt kapsel xenografting av prostata celle rekombinante grafts eller prostata vev xenografts, som er teknikker mye brukt i prostata forskning 17-19. Samlet utgjør disse teknikkene har en kraftfull tilnærming til å s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke alle medlemmer av Ricke lab, fortid og nåtid. Vi takker Calvin Patten, Jr, DVM og Brigitte Raabe, DVM, for nyttige kommentarer til protokollen. Vi ønsker å takke NIDDK, NCI, og NIEHS for sin økonomiske støtte til disse studiene: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN er en trainee i Medical Scientist Training Program ved University of Rochester finansiert av NIH T32 GM07356; NIH henhold Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 støtter også dette prosjektet. CDV er støttet av T32CA157322 og ABT er støttet av T32ES007015 ved University of Wisconsin-Madison. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute of General Medical Sciences eller NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
References
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
