Njurar Capsule Xenografting och subkutan Pellet Implantation för utvärdering av Prostata Carcinogenesis och godartad prostataförstoring
Summary
Vi beskriver framställningen av komprimerade hormon pelletar samt subkutan kirurgisk implantering i möss. Denna strategi kan kombineras med tillväxten av cell-och vävnads implanterad under njurkapseln i atymiska nakna möss för att utvärdera hormonell cancer och reglering av godartad prostatatillväxt.
Abstract
Nya behandlingar för två vanliga prostatasjukdomar, prostatacancer (PRCA) och godartad prostataförstoring (BPH), beror i hög grad på experiment utvärderar deras hormonella reglering. Sex steroidhormoner (främst androgener och östrogener) är viktiga i PRCA och BPH, vi sondera deras respektive roller i att framkalla prostatatillväxt och cancer i möss med experiment med komprimerade hormon pellets. Hormon-och / eller drog pellets lätt tillverkas med en pelletspress, och inopererade i den subkutana vävnaden av den manliga musen värd. Vi beskriver också ett protokoll för utvärdering av hormonell cancer genom att kombinera subkutana hormonpellets implantation med Xenografting prostatacell rekombinanter under njurkapseln av nedsatt immunförsvar möss. Dessutom subkutan hormon pellet implantering i kombination med njurkapseln xenografting av BPH vävnad, är användbar för att bättre förstå den hormonella regleringen av godartad proståt tillväxten, och att testa nya behandlingar riktade könssteroidhormon vägar.
Introduction
Prostatacancer (PRCA) och godartad prostataförstoring (BPH) är betydande hälsoproblem. PRCA är den näst vanligaste solida organ cancer hos män och den främsta orsaken till cancerrelaterad död 1. BPH är också mycket utbrett bland äldre män, och det beräknas att den kliniska manifestationen av BPH, nedre urinvägssymptom (LUTS), kommer att påverka 50-90% av män 2. Medan androgener och östrogener är kända för att vara viktiga i PRCA och BPH, vår förståelse av de hormonella mekanismer som ligger bakom cancer och tillväxten är fortfarande ofullständig 3,4. Enkla och genetiskt tractable djurmodeller bygga de studier som kommer att ta upp dessa prioriteringar i prostata forskning. I hormon lyhörd sjukdomar som PRCA och BPH, användning av subkutana, långsam frisättning hormon pellets, ensamt eller i kombination med njurkapseln xenografting (överföring av celler, vävnader eller organ från en art till en annan) i immunocompromised mus värd, ger en enkel och reproducerbar metod för att studera hormonell reglering av tillväxt och cancer.
Subkutan hormon pelleten implantation är en enkel och reproducerbar teknik för att studera den hormonella regleringen av carcinogenes och godartad tillväxt i prostatan 5. Subkutan implantation av vuxna manliga möss med 25 mg testosteron (T) och 2,5 mg 17β-östradiol (E2), orsakar en ökning av serum E 2 och gradvis minskning av T, återskapa den dynamiska hormonella miljön i åldrande män 5,6. Dessutom rekapitulerar denna modell många av de kliniska funktionerna i BPH-LUTS 5,7. Alternativa metoder för hormon administration innefattar oral / sondmatning administration eller intraperitoneal injektion, som orsakar lidande hos gnagare, mindre konsekventa i att leverera samma mängd läkemedel över tid, och är mer arbetsintensiv än en engångs kirurgisk implantation. Andra subkutana lägen för hormone och / eller läkemedelstillförsel inkluderar Silastic kapslar 8. Medan vi har också erfarenhet av användning av Silastic kapslar, pressas pellets gynnad för sin användarvänlighet och reproducerbarhet. Dessutom frisättningshastigheter av komprimerade hormon pellets bättre efterlikna de dynamiska könssteroidhormonförhållanden som observerats i åldrande män 5,7.
Eftersom utvecklingen av genetiskt immunsupprimerade möss har otaliga in vivo modellsystem som inkorporerar xenografting tekniker utvecklats för studier av ett stort antal olika normala och sjuka vävnader. Det finns flera grundläggande kategorier av xenografting. Vävnads xenotransplantat bestå av en liten bit av intakt vävnad, som kan vara en normal struktur, malign tumör, eller godartad tillväxt. Szot et al. (2007) har nyligen upplyst njurkapseln Xenografting pankreasöar 9. Aamdal et al. (1985) beskrev njurkapseln xenografting av 27 humana cancercellinjer i immunocompromised mus är värd 10. Grafts kan också vara sammansatt av en enda odödliggjord cellinje (cancerösa eller icke-tumorogen), eller kan bestå av en immortaliserad cellinje kombineras med celler isolerade från mesenkym (cell rekombinant graft).
Vi föredrar Xenografting cell rekombinanter att söka respektive roller stroma och epitel i utvecklingen av PRCA och BPH. Cunha et al. (1980) var först med att rapportera att när vuxna murina blåsans epitel kombineras med embryonala urogenital sinus mesenkymet (UGM) och xenografted under njurkapseln hos hanmöss värdar, utvecklar vävnaden i strukturer som liknar prostata acini 11. Norman et al. (1986) visade att vuxen mus prostata duktal epitel och UGM, när de kombineras i vävnads rekombinanter, genomgå duktal tillväxt och förgrening morfogenes 12. Hayward et al. (1988) visade att den mänskliga prostata epitel reagerar på induktiva foster mesenchyme på ett liknande sätt 13. En hormonell modell av cancer i prostata, genom att kombinera den förevigat mänskliga prostata epitelcellinje BPH-1 med UGM, rapporterades först av Wang et al. 14 (2001) och har använts i stor utsträckning i vårt laboratorium 15. Denna modell lämpar sig väl för att förstå PRCA progression eftersom godartad prostata epitel förvandlas till metastatisk sjukdom, modellering avancerad PRCA hos människor 5. Eftersom specifika komponenter kan vara genetiskt manipulerade, är cell rekombinant ympning särskilt användbar som en metod för att utvärdera stromal-epithelial interaktioner.
Andra platser som är lämpliga för xenografting är intradermal, subkutan och orthotopic platser 16. Beroende på vävnaden och sjukdomsprocess av intresse, kan dessa vara lämpliga alternativa metoder. För studier av prostata hormonell cancer och godartad tillväxt reglering, väljer vi den njurkapselnplats för Xenografting grund av dess högre graft tar ränta, riklig blodtillförsel, och förmåga att implantera ett större antal xenografter i en begränsad plats 16. Dessutom hormonell manipulering av värdmusen som resulterar i prostatisk atrofi begränsar användningen av prostata orthotopic ympning 16.
Detta protokoll beskriver tekniker för komprimerad hormon / drogpelletstillverkning och kirurgisk implantation, liksom njurkapseln Xenografting mänskliga prostata cell-och vävnadstransplantat. Tillsammans ger dessa tekniker ger en känslig analys för att fastställa om en genetiskt modifierad mus är mer mottagliga för PRCA och / eller BPH initiering än kontrollstammar. Xenografting är en kraftfull teknik för in vivo-utvärdering av potentialen av experimentella celler att utveckla histologiska och molekylära egenskaperna hos malignitet, samt en analys för nya behandlingsstrategier för en bred variation av benigna och maligna sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument och protokoll som beskrivs häri beskriver tillverkningen av komprimerad hormon-och / eller drog pellets, och det kirurgiska ingreppet för subkutan pellets implantation av möss. Beroende på forskningsfrågan tas upp, kan denna teknik utföras var för sig, eller i kombination med njurkapseln Xenografting prostatacell rekombinanta transplantat eller prostatavävnad implanterad, som är tekniker som ofta används i prostata forskning 17-19. Sammantaget ger dessa tekniker erbjuder en kraftfull …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka alla medlemmar i Ricke labbet, förr och nu. Vi tackar Calvin Patten, Jr, DVM och Brigitte Raabe, DVM, för hjälp synpunkter på protokollet. Vi vill tacka för den NIDDK, NCI, och NIEHS för sitt ekonomiska stöd till dessa studier: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN är en praktikant i Medicinsk Scientist Training Program vid University of Rochester som finansieras av NIH T32 GM07356, NIH enligt Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 stöder också projektet. CDV stöds av T32CA157322 och ABT stöds av T32ES007015 vid University of Wisconsin-Madison. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of General medicinska vetenskaper eller NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
References
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
