Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates

Summary

I 2001, beskrev forskere ved UCLA isolering av en befolkning på voksne stamceller, betegnes Adipose-avledet stamceller eller ASCs, fra fettvev. Denne artikkelen beskriver isolering av ASCs fra lipoaspirates ved hjelp av en manuell, enzymatisk fordøyelse protokollen ved hjelp av collagenase.

Abstract

I 2001, beskrev forskere ved University of California, Los Angeles, isolering av en ny populasjon av voksne stamceller fra utsugd fettvev som de i utgangspunktet betegnes Behandlet Lipoaspirate Celler eller PLA celler. Siden da har disse stamcellene blitt omdøpt til adipose-avledet stamceller eller ASCs og har gått videre til å bli en av de mest populære adulte stamceller populasjoner innen stamcelleforskning og regenerativ medisin. Tusenvis av artikler nå beskrive bruken av ascs i en rekke regenerative dyremodeller, inkludert ben regenerering, perifer nervereparasjon og hjerte-engineering. Nyere artikler har begynt å beskrive mengde bruksområder for ASCs i klinikken. Protokollen vist i denne artikkelen beskriver den grunnleggende prosedyren for manuell og enzymatisk isolere ASCs fra store mengder lipoaspirates hentet fra kosmetiske prosedyrer. Denne protokollen kan lett skaleres opp eller ned til boligen ispiste volumet av lipoaspirate og kan tilpasses til å isolere ascs fra fettvev oppnås gjennom mageoppstrammingsoperasjoner og andre lignende fremgangsmåter.

Introduction

I 2001, ble en antatt bestand av multipotente stamceller fra fettvev beskrevet i tidsskriftet Tissue Engineering ^en. Disse cellene ble gitt navnet Bearbeidet Lipoaspirate eller PLA celler på grunn av deres avledning fra bearbeidet lipoaspirate vev innhentet gjennom kosmetisk kirurgi. Isoleringen metoden beskrevet i denne artikkelen, var basert på eksisterende enzymatiske strategier for isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra fettvev ^2. Den SVF har blitt definert som en minimal behandlet populasjon av røde blodceller, fibroblaster, endotelceller, glatte muskelceller, pericytes og pre-adipocytter som ennå har til å følge en vev kultur substrat ^{to, tre.} Dyrking av denne SVF over tid er foreslått for å eliminere mange av disse forurensende celle-populasjoner og resultere i en fastsittende, fibroblastisk populasjon. Disse fibroblaster er blitt identifisert i litteraturen i de siste 40 år som blir forhåndsadipocytter. Men vår forskergruppe vist at disse cellene besatt mesodermal multipotency og omdøpt tilhenger SVF befolkningen som PLA celler. Senere studier av en rekke andre forskningsmiljøer har lagt til dette potensialet, noe som tyder på både endodermal og ectodermal potensialer (for gjennomgang se ^4). Siden den gang har mange tilleggsvilkår for disse cellene dukket opp i litteraturen. For å gi noen form for enighet, ble begrepet adipose-avledet stamceller eller ASCs vedtatt på 2 ^nd årlige IFATS konferansen. Derfor vil uttrykket ASC brukes i denne artikkelen.

Den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen, er en relativt enkel fremgangsmåte som krever standard laboratorieutstyr og bruker enkle reagenser slik som fosfo-bufret saltløsning, standard tissue culture media reagenser og kollagenase. Det kan produsere store mengder ascs avhengig av mengden av utgangs fettvev volum og påfølgende culture tid. Imidlertid kan behandlingen av en slik stor mengde av fettvev presentere noen fysiske problemer som kan reduseres til en viss grad ved bruk av denne protokoll. Videre gjør denne protokollen krever sterile vevskultur-anlegg og som er godkjent for biologisk hetter, og derved nødvendiggjøre bruk av en godkjent vevskultur anlegg. Dette kravet kan også redusere nytten av ASC befolkningen i kliniske applikasjoner med mindre de er isolert i Good Manufacturing Practice (GMP)-godkjente anlegg designet for isolering og utvidelse av materialer for klinisk bruk. Som et alternativ, ville automatiserte systemer som kan isolere ascs i et lukket system i operasjonssalen unngå dette viktige spørsmålet og la for umiddelbar bruk av ascs uten behov for etterfølgende in vitro-ekspansjon. Til dags dato, er det seks automatiserte systemer som er tilgjengelige i handelen for isolering av celler fra humant vev. Disse systemer kan gjøre det mulig å isolere enbetydelig antall ASCs fra store mengder fettvev umiddelbart etter sin avling. Disse ASCs kan da bli gjeninnført i pasienten for en rekke av regenerativ formål uten pasienten å måtte forlate operasjonssalen. I tillegg til denne protokollen beskriver manuell isolering av ascs, er en protokoll for automatisert isolering av ascs hjelp av Celution System også gitt i et ledsagende artikkelen.

Protocol

Protokollen vist her beskriver den manuelle isolering av ASCs fra lipoaspirates innhentet gjennom kosmetiske prosedyrer ved hjelp av enzymatisk fordøyelse og differensial sentrifugering. Denne protokollen ble først publisert i tidsskriftet Tissue Engineering i 2001 en, der de resulterende cellene ble kalt Behandlet Lipoaspirate Celler eller PLA celler på grunn av sin isolasjon fra lipoaspirates. Imidlertid har begrepet PLA cellen nå blitt erstattet med begrepet Adipose-avledet stamceller eller ASC…

Representative Results

Protokollen skisse over beskriver en manuell, enzymatisk fremgangsmåte for isolering av en SVF fra et stort volum lipoaspirate prøven. Innenfor denne SVF er mange cellepopulasjoner, inkludert ASC. Tallrike studier foreslår at dyrkning av denne SVF under standard vevskulturbetingelser vil selektere for en fastsittende fibroblast populasjon sannsynlig å være sammensatt hovedsakelig av ASC type. I samsvar med dette har vi vist, ved hjelp av flyt-cytometri og immunfluorescens, som dyrkede SVF pellets blir i det vesentl…

Discussion

Fettvev for isolering av ASCs kan komme i mange former: fra solide biter av vev innhentet gjennom reseksjon eller fettsuging til mindre biter innhentet gjennom enten sprøyte utvinning eller inntaks-assistert fettsuging (dvs. fettsuging). Enten flere SVF celler (og dermed ASCs) kan fås fra reseksjon eller aspirerte adipose prøvene er uklart så motstridende studier har blitt presentert ^{16, 17.} Det er mulig at enten form av fettvev er mer enn egnet for isolering av SVF celler og ascs så lenge som o…

Materials

			Reagent
DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)	Mediatech Cellgro	10-013-CV	with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin	Mediatech Cellgro	30-002-CI	10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B	Mediatech Cellgro	30-003-CF	250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline)	Mediatech Cellgro	25-053-CI	without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA	Mediatech Cellgro	20-031-CV	0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum)	Sigma	C2674	crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated	Gemini Bioproducts	100106	USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-104
25 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes	Genesee Scientific	21-106
100 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-202
150 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-203
500 ml Stericup Filter Units	Millipore	SCGPU05RE	PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers	FisherBrand	22-363-549	100 μm nylon mesh
dexamethasone – water soluble	Sigma	D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate	Sigma	A-8960
β-glycerophosphate disodium salt	Sigma	G-9422	also known as glycerophosphate
insulin	Sigma	I-6634	made from bovine pancreas
indomethacin	Sigma	I-7378
apo-transferrin	Sigma	T-4382
TGFβ1	R&D Systems	240-B-002	recombinant human
Oil Red O	Sigma	O-0625
Alcian Blue	Sigma	A-5268
Silver nitrate	Sigma	S-0319
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	30525-89-4	supplied as a 16 % stock
			[header]
			Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood	Thermo Scientific		ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge	Hermle Labnet	Z383	Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	S52602Q	5-10L capacity, capable of 37 C
Automated Pipette Aids	Drummond Pipette Aid XL	4-000-105
CO2 Incubator	Thermo Scientific	Forma 310	direct heat or water jacketed