I 2001, beskrev forskere ved UCLA isolering av en befolkning på voksne stamceller, betegnes Adipose-avledet stamceller eller ASCs, fra fettvev. Denne artikkelen beskriver isolering av ASCs fra lipoaspirates ved hjelp av en manuell, enzymatisk fordøyelse protokollen ved hjelp av collagenase.
I 2001, beskrev forskere ved University of California, Los Angeles, isolering av en ny populasjon av voksne stamceller fra utsugd fettvev som de i utgangspunktet betegnes Behandlet Lipoaspirate Celler eller PLA celler. Siden da har disse stamcellene blitt omdøpt til adipose-avledet stamceller eller ASCs og har gått videre til å bli en av de mest populære adulte stamceller populasjoner innen stamcelleforskning og regenerativ medisin. Tusenvis av artikler nå beskrive bruken av ascs i en rekke regenerative dyremodeller, inkludert ben regenerering, perifer nervereparasjon og hjerte-engineering. Nyere artikler har begynt å beskrive mengde bruksområder for ASCs i klinikken. Protokollen vist i denne artikkelen beskriver den grunnleggende prosedyren for manuell og enzymatisk isolere ASCs fra store mengder lipoaspirates hentet fra kosmetiske prosedyrer. Denne protokollen kan lett skaleres opp eller ned til boligen ispiste volumet av lipoaspirate og kan tilpasses til å isolere ascs fra fettvev oppnås gjennom mageoppstrammingsoperasjoner og andre lignende fremgangsmåter.
I 2001, ble en antatt bestand av multipotente stamceller fra fettvev beskrevet i tidsskriftet Tissue Engineering en. Disse cellene ble gitt navnet Bearbeidet Lipoaspirate eller PLA celler på grunn av deres avledning fra bearbeidet lipoaspirate vev innhentet gjennom kosmetisk kirurgi. Isoleringen metoden beskrevet i denne artikkelen, var basert på eksisterende enzymatiske strategier for isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra fettvev 2. Den SVF har blitt definert som en minimal behandlet populasjon av røde blodceller, fibroblaster, endotelceller, glatte muskelceller, pericytes og pre-adipocytter som ennå har til å følge en vev kultur substrat to, tre. Dyrking av denne SVF over tid er foreslått for å eliminere mange av disse forurensende celle-populasjoner og resultere i en fastsittende, fibroblastisk populasjon. Disse fibroblaster er blitt identifisert i litteraturen i de siste 40 år som blir forhåndsadipocytter. Men vår forskergruppe vist at disse cellene besatt mesodermal multipotency og omdøpt tilhenger SVF befolkningen som PLA celler. Senere studier av en rekke andre forskningsmiljøer har lagt til dette potensialet, noe som tyder på både endodermal og ectodermal potensialer (for gjennomgang se 4). Siden den gang har mange tilleggsvilkår for disse cellene dukket opp i litteraturen. For å gi noen form for enighet, ble begrepet adipose-avledet stamceller eller ASCs vedtatt på 2 nd årlige IFATS konferansen. Derfor vil uttrykket ASC brukes i denne artikkelen.
Den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen, er en relativt enkel fremgangsmåte som krever standard laboratorieutstyr og bruker enkle reagenser slik som fosfo-bufret saltløsning, standard tissue culture media reagenser og kollagenase. Det kan produsere store mengder ascs avhengig av mengden av utgangs fettvev volum og påfølgende culture tid. Imidlertid kan behandlingen av en slik stor mengde av fettvev presentere noen fysiske problemer som kan reduseres til en viss grad ved bruk av denne protokoll. Videre gjør denne protokollen krever sterile vevskultur-anlegg og som er godkjent for biologisk hetter, og derved nødvendiggjøre bruk av en godkjent vevskultur anlegg. Dette kravet kan også redusere nytten av ASC befolkningen i kliniske applikasjoner med mindre de er isolert i Good Manufacturing Practice (GMP)-godkjente anlegg designet for isolering og utvidelse av materialer for klinisk bruk. Som et alternativ, ville automatiserte systemer som kan isolere ascs i et lukket system i operasjonssalen unngå dette viktige spørsmålet og la for umiddelbar bruk av ascs uten behov for etterfølgende in vitro-ekspansjon. Til dags dato, er det seks automatiserte systemer som er tilgjengelige i handelen for isolering av celler fra humant vev. Disse systemer kan gjøre det mulig å isolere enbetydelig antall ASCs fra store mengder fettvev umiddelbart etter sin avling. Disse ASCs kan da bli gjeninnført i pasienten for en rekke av regenerativ formål uten pasienten å måtte forlate operasjonssalen. I tillegg til denne protokollen beskriver manuell isolering av ascs, er en protokoll for automatisert isolering av ascs hjelp av Celution System også gitt i et ledsagende artikkelen.
Fettvev for isolering av ASCs kan komme i mange former: fra solide biter av vev innhentet gjennom reseksjon eller fettsuging til mindre biter innhentet gjennom enten sprøyte utvinning eller inntaks-assistert fettsuging (dvs. fettsuging). Enten flere SVF celler (og dermed ASCs) kan fås fra reseksjon eller aspirerte adipose prøvene er uklart så motstridende studier har blitt presentert 16, 17. Det er mulig at enten form av fettvev er mer enn egnet for isolering av SVF celler og ascs så lenge som o…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne og takke de ytterligere forskning personell som bidro til utviklingen av den beskrevne protokollen og dens isolasjon av ASCs, inkludert: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, og Dr. John Fraser, PhD. Resultatene presenteres ble finansiert delvis av forskningsmidler fra National Institutes of Health, inkludert de NIAMS og NIDCR Institutes.
Reagent | |||
DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
indomethacin | Sigma | I-7378 | |
apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
[header] | |||
Equipment Needed | |||
Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |