Manuell Isolering av Fett-härledda stamceller från mänskliga Lipoaspirates

Summary

År 2001, forskare vid UCLA beskrev isoleringen av en population av stamceller från vuxna, benämnd Fett-derived stamceller eller ASCs, från fettvävnad. Den här artikeln beskriver isolering av ASCs från lipoaspirates med en manuell, enzymatisk spjälkning protokollet använder kollagenas.

Abstract

År 2001, forskare vid University of California, Los Angeles, beskrev isoleringen av en ny population av adulta stamceller från fettsugning fettvävnad att de initialt kallas Bearbetade Lipoaspirate Celler eller PLA-celler. Sedan dess har dessa stamceller döpts som Fett-härledda stamceller eller ASCs och har gått vidare till att bli en av de mest populära vuxna stamceller populationer inom områdena stamcellsforskning och regenerativ medicin. Tusentals artiklar beskrivs nu användningen av ASC: er i en mängd olika regenerativa djurmodeller, inklusive benregenerering, perifer nervreparation och hjärt-engineering. Nya artiklar har börjat för att beskriva den mängd olika användningsområden för ASCs i kliniken. Det protokoll som visas i den här artikeln beskriver den grundläggande proceduren för manuell och enzymatiskt isolera ASCs från stora mängder lipoaspirates erhållits från kosmetiska behandlingar. Detta protokoll kan enkelt skalas upp eller ner för att accommodåt volymen lipoaspirate och kan anpassas för att isolera DSKer från fettvävnad erhållna genom abdominoplasties och liknande förfaranden.

Introduction

År 2001 var en förmodad befolkning på multipotenta stamceller från fettvävnad som beskrivs i tidskriften Tissue Engineering ^1. Dessa celler fick namnet Bearbetade Lipoaspirate eller PLA-celler på grund av deras härledning från bearbetad lipoaspirate vävnad som erhållits genom plastikkirurgi. Isoleringen metod som beskrivs i den här artikeln byggde på befintliga enzymatiska strategier för isolering av stromaceller vaskulära fraktion (SVF) från fettvävnad ^2. Den SVF har definierats som ett minimalt bearbetade population av röda blodceller, fibroblaster, endotelceller, glatta muskelceller, pericyter och pre-adipocyter som ännu inte hålla sig till en vävnadsodlingssubstrat ^{2, 3.} Odling av denna SVF över tiden har föreslagits för att eliminera många av dessa kontaminerande cellpopulationer och resulterar i en vidhäftande, fibroblastisk befolkning. Dessa fibroblaster har identifierats i litteraturen för de senaste 40 åren som är pre-adipocyter. Men vår forskargrupp visat att dessa celler hade mesodermal multipotency och döptes den vidhäftande SVF befolkningen som PLA-celler. Efterföljande studier av ett stort antal andra forskargrupper har lagt till denna potential, vilket tyder både endodermalt och ektodermala potentialer (för översikt se ^4). Sedan dess har ett flertal ytterligare termer för dessa celler föreföll i litteraturen. För att ge någon typ av konsensus, blev termen Adipose-härledda stamceller eller ASCs antogs vid den ^{2: a} årliga konferens IFATS. Som sådan kommer termen ASC användas i den här artikeln.

Protokollet beskrivs i denna artikel är en relativt enkel procedur som kräver standard laboratorieutrustning och använder enkla reagenser såsom fosfor-saltlösning, standardvävnadsodlingsmedier reagenser och kollagenas. Den kan producera ett stort antal DSKer beroende på mängden av utgångs fettvävnad volym och efterföljande cKULTUR tid. Emellertid kan behandling av en sådan stor mängd av fettvävnad presentera några fysiska problem som kan minskas till en grad med hjälp av detta protokoll. Dessutom går detta protokoll kräver sterilt odlingsanläggningar och godkända biosäkerhet huvor, vilket nödvändiggör användning av en godkänd vävnadskultur anläggning. Detta krav kan också minska nyttan av ASC populationen i kliniska tillämpningar, om de är isolerade i god tillverkningssed (GMP)-godkända anläggningar avsedda för isolering och expansion av material för klinisk användning. Som ett alternativ, skulle automatiserade system som kan isolera ASCs i ett slutet system i operationssalen undvika denna viktiga fråga och möjliggöra omedelbar användning av ASCs utan behov av efterföljande in vitro expansion. Till dags dato finns det sex automatiserade system som är kommersiellt tillgängliga för isolering av celler från human vävnad. Dessa system kan göra det möjligt att isolera enbetydande antal ASCs från stora mängder fettvävnad omedelbart efter sin skörd. Dessa ASCs kan sedan återinföras i patienten för olika regenerativa ändamål utan patienten någonsin behöva lämna operationssalen. Utöver detta protokoll beskriver manuell isolering av DSK: er, är ett protokoll för automatiserad isolering av DSK: er med hjälp av Celution systemet också i en kamrat artikel.

Protocol

Protokollet visas här beskriver manuell isolering av ASCs från lipoaspirates erhållits genom kosmetiska behandlingar med hjälp av enzymatisk nedbrytning och differentialcentrifugering. Detta protokoll publicerades först i tidskriften Tissue Engineering 2001 1, där de resulterande cellerna kallades Bearbetade Lipoaspirate celler eller PLA-celler på grund av deras isolering från lipoaspirates. Däremot har termen PLA cellen nu ersatts med begreppet Fett-derived stamceller eller ASCs att…

Representative Results

Protokollet kontur ovan beskriver en manuell, enzymatisk metod för isoleringen av en SVF från en stor volym lipoaspirate provet. Inom denna SVF finns många cellpopulationer, inklusive ASC. Ett flertal studier föreslår att odla denna SVF under standardvävnadsodlingsbetingelser kommer att välja för en vidhäftande fibroblast kan antas komma att i huvudsak bestå av typen ASC. I överensstämmelse med detta har vi visat, med användning av flödescytometri och immunofluorescens, att odlade SVF pellets bli väsentli…

Discussion

Fettvävnad för isolering av ASCs kan komma i många former: från fasta bitar av vävnad som framställts genom resektion eller lipoplasty till mindre bitar som erhållits genom antingen spruta extraktion eller sug-assisterad lipoplasty (dvs. fettsugning). Huruvida fler SVF celler (och därmed ASCs) kan erhållas från opererande eller aspirefettprover är oklart motstridiga studier har presente ^{16, 17.} Det är möjligt att någon form av fettvävnad är mer än lämplig för isolering av SVF celle…

Materials

			Reagent
DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)	Mediatech Cellgro	10-013-CV	with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin	Mediatech Cellgro	30-002-CI	10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B	Mediatech Cellgro	30-003-CF	250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline)	Mediatech Cellgro	25-053-CI	without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA	Mediatech Cellgro	20-031-CV	0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum)	Sigma	C2674	crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated	Gemini Bioproducts	100106	USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-104
25 ml serological pipettes	Genesee Scientific	12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes	Genesee Scientific	21-106
100 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-202
150 mm tissue culture dishes	Genesee Scientific	25-203
500 ml Stericup Filter Units	Millipore	SCGPU05RE	PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers	FisherBrand	22-363-549	100 μm nylon mesh
dexamethasone – water soluble	Sigma	D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate	Sigma	A-8960
β-glycerophosphate disodium salt	Sigma	G-9422	also known as glycerophosphate
insulin	Sigma	I-6634	made from bovine pancreas
indomethacin	Sigma	I-7378
apo-transferrin	Sigma	T-4382
TGFβ1	R&D Systems	240-B-002	recombinant human
Oil Red O	Sigma	O-0625
Alcian Blue	Sigma	A-5268
Silver nitrate	Sigma	S-0319
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	30525-89-4	supplied as a 16 % stock
			[header]
			Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood	Thermo Scientific		ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge	Hermle Labnet	Z383	Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	S52602Q	5-10L capacity, capable of 37 C
Automated Pipette Aids	Drummond Pipette Aid XL	4-000-105
CO2 Incubator	Thermo Scientific	Forma 310	direct heat or water jacketed