Vi genetiskt koda den onaturliga aminosyror, p-azido-L-fenylalanin vid olika riktade positioner i GPCRs och visar mångsidigheten hos azidogrupp i olika applikationer. Dessa inkluderar en riktad fototvär teknik för att identifiera rester i den ligandbindande fickan hos en GPCR, och sätesspecifik bioorthogonal modifiering av GPCR: er med en peptid-epitop-tag eller fluorescerande sond.
För att underlätta strukturell och dynamiska studier av G-proteinkopplad receptor (GPCR) signaleringskomplex, är nya metoder som krävs för att införa informations prober eller etiketter i uttryckta receptorer som inte perturb receptorfunktion. Vi använde amber kodon undertryckande teknik för att genetiskt koda den onaturliga aminosyror, p-azido-L-fenylalanin (AZF) vid olika riktade positioner i GPCRs heterologt uttryckta i däggdjursceller. Mångsidigheten azidogruppen illustreras här i olika applikationer för att studera GPCRs i deras naturliga cellulära miljö eller under tvätt-och rengöringsmedel upplösta förhållanden. Först visar vi en cellbaserad riktad fototvär teknik för att identifiera rester i ligand-bindande fickan på GPCR där en tritiummärkt småmolekylära ligand tvärbunden till en genetiskt kodad azido aminosyra. Vi visar sedan platsspecifik modifiering av GPCRs av bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaktionning som riktar azidogruppen använda fosfin derivat. Vi diskuterar en allmän strategi för riktade peptid-epitop taggning av uttryckta membranproteiner i-kulturen och dess upptäckt med hjälp av en hel-cell-baserade ELISA-metod. Slutligen visar vi att AZF-GPCR kan selektivt märkta med fluorescerande prober. De metoder som diskuteras är generella, i det att de kan i princip tillämpas på alla aminosyrapositionen i någon uttryckte GPCR att förhöra aktiva signaleringskomplex.
Heptahelical G-proteinkopplade receptorer (GPCR) innefattar en superfamilj av högdynamiska membranproteiner som förmedlar viktiga och olikartade extracellulära signaler. I den klassiska paradigmet, är receptoraktivering i kombination med ligandinducerade konformationsförändringar. 1, har 2 Nya framsteg inom strukturbiologi av GPCRs förutsatt betydande insikt i de molekylära mekanismerna för trans signalering. 3-5 Men för att förstå med ökad kemisk precision funktionell mekanism och strukturdynamik av GPCR signalering, är en verktygslåda med metoder som krävs för att införliva informativa molekylära och kemiska sonder för att förhöra aktiva signaleringskomplex.
För detta ändamål anpassade vi en metod för att sätesspecifikt införa icke-eller minimalt störande prober in uttryckta receptorer baserade på onaturlig aminosyra (UAA) mutagenes med användning amber kodon undertryckande teknik tidigare uppfunnen av Schultz och coworkers. 6 Vi optimerat UAA mutagenes metod för att uppnå en hög avkastning uttryck och mutagenes system för proteiner såsom GPCRs, som är svåra att uttrycka i andra än däggdjursceller mest heterologa system. Med hjälp av en ortogonal konstruerad suppressor tRNA och utvecklats aminoacyl-tRNA-syntetas paret för en specifik UAA, vi platsspecifikt infört UAAs i uttryckta mål GPCRs. Den framgångsrika inkorporeringen av UAAs, p-acetyl-L-fenylalanin (ACF), p-bensoyl-L-fenylalanin (BZF), och p-azido-L-fenylalanin (AZF) har visats i våra modell GPCRs – rhodopsin och humant CC kemokinreceptorn, CCR5. 7, 8
I princip kan en UAA vara genetiskt kodade vid någon position inom proteinsekvensen och den här egenskapen är ett ovärderligt biokemiska verktyg eftersom det möjliggör enkel-kodon skanning av ett mål GPCR. Vi fokuserar här på just mångsidigheten hos UAA, AZF, som har en reaktiv azido-delen. Förutom att fungera som en unik infraröd (IR) sond, 8, 9 AZF kan också fungera som ett fotoaktiverbart tvärbindningsmedel genom att reagera med de angränsande primära aminer eller alifatiska väten. Dessutom kan biologiskt inert azidogrupp delta som ett selektivt kemiskt handtag i bioorthogonal märkningsreaktioner. Här presenterar vi exempel som illustrerar de användbara tillämpningar av platsspecifik inkorporering av AZF i GPCRs, såsom riktad fototvär att fånga en receptor-ligand-komplex, och modifiering av GPCRs genom bioorthogonal epitop taggning och fluorescerande strategier märkning.
Fotoaktiverbara reagens har använts för att studera biologiska system sedan 1960-talet. 10 Under denna period har ett överflöd av receptor-ligand tvärbindningsförsök rapporterats att studera GPCR komplex, deltar de flesta av vilka användningen av fotoaffinitetsligander. 11, 12 Men dessa applikationer är tekniskt begränsade, eftersom de kräe syntes av ligander som bär en tvärbindningsgrupp. 13-15 Dessutom med tvärbinddelen i liganden, det är svårt att identifiera platsen för tvärbindning på GPCR. Platsspecifikt införande av fototvär grupper som UAAs i proteiner med användning av den gula kodonet undertryckande teknologi är ett värdefullt framsteg. 16, 17 Vi utvecklade en fototvär teknik för att identifiera det bindande gränssnittet på en receptor som är involverad i bildningen av ett receptor-ligand-komplex i levande celler genom införande av fotolabila grupper till GPCR. 18, 19 Här beskriver vi den experimentella protokollet och metod för dataanalys för att tillämpa denna riktad fototvär teknik för att identifiera bindningsstället av en liten molekyl liganden tritierad maravirok å CCR5. Metoden drar nytta av exakt kvantifiering av den radioaktiva handtaget på liganden, förutom att behålla den nativa kemiska strukturen av liganden.
Fluorescensbaserade tekniker stöder exakt förståelse för den strukturella basen av receptoraktivering genom att direkt sondera konformationstillstånd av receptorn. 20, 21 emellertid, tekniker som har den flexibiliteten att införa fluorescerande markörer i GPCRs platsspecifikt är begränsade. Vi är intresserade av att anställa bioorthogonal kemisk modifiering strategier för att underlätta enda molekyl upptäckt (SMD) i GPCR signalering komplex. 22 azidogruppen kan delta i bioorthogonal kemiska sammansättningar såsom Staudinger-Bertozzi ligation, 23, 24 koppar-fri stam-främjade azid- alkyn cykloadditionen (SpAAC) 25 och koppar-katalyseras azid-alkyn cykloadditionen (CuAAC). 26 Vi fokuserar här på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktion som involverar den specifika reaktionen mellan en azid och en fosfin. Vi visar användningen av två olika fosfin-derivat, konjugerade till en peptid-epitop (FLAG-peptid) eller en fluorescerande märkning(Fluorescein) för att uppnå platsspecifik modifiering av GPCR.
Vi har tidigare optimerat förutsättningarna för platsspecifik märkning av rhodopsin AZF varianter med hjälp av röntgenkristallstruktur och dynamiska simuleringar för att välja mål webbplatser som är lösningsmedels utsatta. 27, 28 Vi illustrerade också möjligheten att nå bakgrundsfria märkning av Staudinger- Bertozzi ligering. 29 Vi visar här av den vanliga proceduren för att uppnå fluorescensmärkning av en detergent-solubiliserat receptor som är immobiliserad på en immunaffinitetsmatris och därefter visualiseras genom in-gel-fluorescens. Dessutom visar vi en bra förlängning på denna märkning strategi för att identifiera positioner bli föremål för märkning på en receptor av okänd struktur, CCR5. Detta sker med hjälp av en riktad peptid-epitop tagg strategi som bygger på bioorthogonal modifiering av AZF-GPCR varianter i ett cellbaserat halv hög genomströmning format. 30 DettaMetoden utnyttjar flerstegsdetekteringsegenskaperna hos en cellyt-ELISA för att övervaka märkningshändelser.
De metoder som vi diskuterar här är generella och i princip kan tillämpas på alla GPCR införlivas med AZF hjälp av amber kodon dämpning teknik. I de protokoll som presenteras här vi i detalj de steg som ingår i däggdjurscelluttryck av receptorer införlivas med UAAs såsom AZF med hjälp av onaturliga aminosyror mutagenes metod och deras efterföljande ansökningar för att underlätta strukturella och dynamiska studier av GPCRs.
Vi beskriver här en lämplig metod för platsspecifik inkorporering av en reaktiv sond, AZF, i GPCRs och demonstrera tre användbara tillämpningar av detta verktyg för att studera struktur och dynamik av GPCRs. Vår metod för att platsspecifikt införliva UAAs kringgår ett grundläggande problem med en alternativ strategi som bygger på kemisk märkning 32, 33 eller fästa fototvärbindare 34 till en enda tillgänglig cystein mutant. Även kemier som riktar cystein tiolgrupper har använts fö…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar generöst stöd av flera stiftelser och filantropiska givare (se SakmarLab.org).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
HEK 293T cells | Adherent cells | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
[header] | |||
Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
[header] | |||
0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
[header] | |||
Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
Table 4. Fluorescent labeling materials |