Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine
Summary
Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.
Abstract
Per facilitare gli studi strutturali e dinamiche di G protein-coupled recettore (GPCR) complessi di segnalazione, sono necessari nuovi approcci per introdurre sonde informativi o etichette in recettori espressi che non perturbano la funzione del recettore. Abbiamo usato ambra tecnologia di soppressione codone geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina (AZF) in diverse posizioni mirate nei GPCR eterologamente espressi in cellule di mammifero. La versatilità del gruppo azido è illustrato qui in applicazioni diverse per studiare GPCR nel loro ambiente nativo cellulare o detergenti in condizioni solubilizzate. In primo luogo, abbiamo dimostrato una tecnologia photocrosslinking mirata basata celle per identificare i residui nella tasca di legame del ligando di GPCR dove una piccola molecola ligando marcato con trizio viene reticolato di un acido ammino azido geneticamente codificati. Abbiamo poi Dimostriamo sito-specifica modifica del GPCR dal bioorthogonal Staudinger-Bertozzi legatura reazionizione che gli obiettivi del gruppo azido mediante derivati fosfina. Discutiamo di una strategia generale per la mirata peptide-epitopo tagging delle proteine di membrana espresse in-cultura e la sua individuazione utilizzando un metodo ELISA basato whole-cell. Infine, dimostriamo che AZF-GPCR possono essere selettivamente contrassegnati con sonde fluorescenti. Le metodologie sono discusse generale, in quanto possono in principio essere applicate a qualsiasi posizione amminoacido in qualsiasi espresso GPCR interrogare complessi di segnalazione attive.
Introduction
Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR Heptahelical) comprendono una superfamiglia di proteine di membrana altamente dinamici che mediano i segnali extracellulari importanti e diverse. Nel paradigma classico, l'attivazione del recettore è accoppiato con i cambiamenti conformazionali ligando-indotta. 1, 2 recenti progressi nel campo della biologia strutturale di GPCR hanno fornito informazioni significative sui meccanismi molecolari della segnalazione transmembrana. 3-5 Tuttavia, per comprendere con maggiore precisione chimica meccanismo funzionale e dinamica strutturale della segnalazione GPCR, un toolkit di approcci sono necessari per incorporare sonde molecolari e chimiche informativi per interrogare complessi di segnalazione attiva.
A tal fine, abbiamo adattato un metodo per sito-specifico di introdurre non o poco sonde perturbanti nella recettori espressi sulla base di aminoacidi innaturale (SAU) mutagenesi con ambra codone tecnologia di soppressione precedentemente introdotta da Schultz ecoworkers. 6 Abbiamo ottimizzato la metodologia mutagenesi SAU per ottenere una espressione ad alto rendimento e sistema di mutagenesi per proteine come GPCR, che sono difficili da esprimere in sistemi eterologhi più diversi dalle cellule di mammifero. L'utilizzo di un silenziatore costruito ortogonale tRNA e si è evoluta-tRNA sintetasi pair per una specifica SAU, noi del sito specificamente introdotto UAAs in GPCR bersaglio espresse. L'incorporazione di successo UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (ACF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), e p-azido-L-fenilalanina (AZF) è stata dimostrata nei nostri GPCR modello – rodopsina e umana recettore CC chemochine, CCR5. 7, 8
In linea di principio, una SAU può essere geneticamente codificato in qualsiasi posizione all'interno della sequenza della proteina e questa proprietà è uno strumento biochimico prezioso in quanto consente la scansione singolo codone di un GPCR bersaglio. Ci concentriamo qui in particolare sulla versatilità della SAU, AZF, che ha una azi reattivafare parte. Oltre a servire come infrarossi (IR) sonda unico, 8, 9 AZF può anche servire come un photoactivatable reticolante per reazione con ammine primarie vicini o idrogeni alifatici. Inoltre, il gruppo azido biologicamente inerte può partecipare come un manico chimica selettiva nelle reazioni di etichettatura bioorthogonal. Qui vi presentiamo esempi che illustrano le applicazioni utili del sito-specifica incorporazione di AZF in GPCR, come photocrosslinking mirato ad intrappolare un complesso recettore-ligando, e la modifica dei GPCR da bioorthogonal codifica epitopo e le strategie in materia di etichettatura fluorescenti.
Photoactivatable reagenti sono stati utilizzati per studiare i sistemi biologici dal 1960. 10 In questo periodo, l'abbondanza di esperimenti reticolazione recettore-ligando sono stati segnalati per studiare complessi GPCR, la maggior parte dei quali ha coinvolto l'uso di leganti fotoaffinità. 11, 12 Tuttavia, questi applicazioni sono tecnicamente limitati, in quanto Require sintesi di leganti recanti un gruppo reticolante. 13-15 Inoltre, con la frazione di reticolante nel ligando, è impegnativo per identificare la posizione della reticolazione sul GPCR. Sito-specifico introducendo photocrosslinking gruppi come UAAs in proteine utilizzando la tecnologia di soppressione ambra codone è un avanzamento importante. 16, 17 Abbiamo sviluppato una tecnica photocrosslinking per identificare l'interfaccia di legame su un recettore che è coinvolto nella formazione di un complesso recettore-ligando in cellule vive introducendo gruppi fotolabili in GPCR. 18, 19 Qui si descrive il protocollo sperimentale e metodo di analisi dei dati per applicare questa tecnologia photocrosslinking mirato per identificare il sito di legame di un ligando piccola molecola, maraviroc triziata, su CCR5. Questo metodo sfrutta la quantificazione precisa del manico sul ligando radioattivo, oltre ad avere la struttura chimica nativa del ligando.
Tecniche basate fluorescenza supportano la precisa comprensione della base strutturale del recettore sondando direttamente lo stato conformazionale del recettore. 20, 21 Tuttavia, le tecniche che hanno la flessibilità necessaria per introdurre etichette fluorescenti in GPCR sito-specifica sono limitati. Siamo interessati a impiegare strategie di modificazione chimica bioorthogonal per facilitare l'individuazione singola molecola (SMD) di complessi di segnalazione GPCR. 22 Il gruppo azido può partecipare a chimiche bioorthogonal come Staudinger-Bertozzi legatura, 23, 24 strain-promosso azide-senza rame cicloaddizione alkyne (SpAAC) 25 e azide-alchino cicloaddizione rame-catalizzato (CuAAC) 26. Ci concentriamo qui sulla reazione legatura Staudinger-Bertozzi che coinvolge la reazione specifica tra un azide e fosfina. Abbiamo dimostrato l'utilizzo di due differenti derivati fosfina, coniugati ad un epitopo peptide (peptide FLAG) o un'etichetta fluorescente(Fluoresceina) per raggiungere sito-specifica modifica del GPCR.
Abbiamo già ottimizzato le condizioni per l'etichettatura sito-specifica della rodopsina varianti AZF utilizzando la struttura cristallina ai raggi X e simulazioni dinamiche di scegliere siti di destinazione che sono solventi esposte. 27, 28 Abbiamo anche illustrato la possibilità di conseguire l'etichettatura libero-background da Staudinger- Bertozzi legatura. 29 dimostriamo qui la procedura generale impiegato per raggiungere marcatura fluorescente di un recettore detergente-solubilizzato che viene immobilizzato su una matrice immunoaffinità e seguito evidenziata in-gel fluorescenza. Inoltre, abbiamo dimostrato un utile estensione di questa strategia di etichettatura per identificare le posizioni suscettibili di etichettatura su un recettore di struttura sconosciuta, CCR5. Questo avviene tramite una mirata strategia di codifica-peptide epitopo che si basa sulla modificazione bioorthogonal di AZF-GPCR varianti in un formato semi-high throughput base cellulare. 30 Questometodo sfrutta le proprietà di rilevamento multi-step di un ELISA superficie cellulare per monitorare gli eventi di etichettatura.
Le metodologie di cui parliamo qui sono generali e in linea di principio può essere applicato a qualsiasi GPCR incorporata con AZF usando l'ambra codone tecnologia di soppressione. Nei protocolli qui presentati dettaglio i passi necessari per l'espressione cellulare di mammifero di recettori incorporato con UAAs come AZF utilizzando il metodo di mutagenesi amminoacido non naturale e successive applicazioni di facilitare studi strutturali e dinamiche di GPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui una solida metodologia per site-specific inserimento di una sonda reattiva, AZF, in GPCR e dimostriamo tre applicazioni utili di questo strumento per studiare la struttura e la dinamica dei GPCR. Il nostro metodo al sito-specifico incorporano UAAs elude un problema fondamentale con una strategia alternativa basata sulla etichettatura chimicamente 32, 33 o allegando photocrosslinkers 34 per una singola cisteina mutante accessibile. Sebbene, chimiche che colpiscono gruppi tiolo della …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il generoso sostegno di numerose fondazioni e filantropi (vedi SakmarLab.org).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| [header] | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| [header] | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| [header] | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. 생화학. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. 생화학. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. 생화학. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. 생화학. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. 생화학. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. 생화학. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
