유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

Summary

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

Abstract

단지 신호 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)의 구조 및 동적 연구를 용이하게하기 위해 새로운 접근 방식은 수용체의 기능을 교란하지 않는 표현 수용체에 정보를 프로브 또는 라벨을 도입해야합니다. 우리는 유 전적으로 인코딩에 앰버 코돈 억제 기술을 사용 부자연 아미노산 heterologously 포유 동물 세포에서 발현의 GPCR의 다양한 표적 위치에서의 P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF). 아지 그룹의 다양성은 그들 나라의 세포​​ 환경이나 세제 용해 된 상태에서의 GPCR을 연구하는 다른 응용 프로그램에서 보여줍니다. 먼저, 트리튬 표지 된 저분자 리간드 유전자 부호화 아지 아미노산 가교 GPCR의 리간드 결합 포켓 잔기를 식별하는 셀 기반 타겟팅 광 가교 기술을 보여준다. 우리는 그 다음 bioorthogonal 딩거 (Staudinger) – BERTOZZI 결찰 REAC로의 GPCR의 사이트의 특정 변형을 보여 주포스 핀 유도체를 사용하는 아지 도기를 대상 기. 우리는 전체 세포 기반 ELISA 방법을 사용하여의 문화와 탐지 표현 막 단백질의 대상 펩티드 에피토프 태그에 대한 일반적인 전략에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 AZF-GPCR에 선택적 형광 프로브로 태그 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 그들은 원칙적으로 활성 신호 복합체를 심문하는 GPCR을 발현 어느 임의의 아미노산 위치에 적용 할 수 있다는 점에서 논의 된 방법은 일반적이다.

Introduction

Heptahelical G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)는 중요하고 다양한 세포 외 신호를 매개하는 매우 역동적 인 막 단백질의 거대 집단을 포함한다. 고전적인 패러다임에서, 수용체의 활성화는 리간드에 의한 구조적 변화와 연결되어있다. ^1,의 GPCR의 구조 ^{생물학에있는} 최근 전진이 횡단 신호의 분자 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. ^{3-5하지만,} 더 큰 화학 정밀도와 이해 기능적인 메커니즘과 GPCR 신호의 구조 역학은, 접근 방법의 툴킷은 활성 신호 단지를 심문하는 정보를 분자 및 화학 프로브를 통합하는 데 필요합니다.

이를 위해, 우리는 사이트 구체적으로 이전 슐츠와 C에 의해 개척 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 자연스러운 아미노산 (UAA) 돌연변이에 따라 표현 수용체에 비 또는 최소가 혼란 프로브를 소개하는 방법을 적용oworkers. ⁶ 우리는 포유 동물 세포 이외의 대부분의 이종 시스템에서 표현하기 어려운의 GPCR과 같은 단백질에 대한 높은 수율의 발현 및 돌연변이 유발 시스템을 달성하기 위해 UAA 돌연변이 유발 방법을 최적화. 직교 설계 회로의 tRNA를 사용하여 특정 UAA에 대한 아미노 아실-tRNA의 합성 쌍을 진화, 우리는 사이트 구체적으로 표현 된 대상의 GPCR에 UAAs을 소개했다. UAAs의 성공적인 결합은, P-아세틸-L-페닐알라닌 (ACF), P-벤조일-L-페닐알라닌 (BZF), 및 p-아지도-L-페닐알라닌 (AZF) 우리의 모델의 GPCR에서 입증되었습니다 – 로돕신과 인간 CC 케모카인 수용체 CCR5. ^{7, 8}

원칙적으로, UAA는 유전자 단백질 시퀀스 내에서 어떤 위치에 인코딩 할 수 있으며,이 목표 GPCR의 단일 코돈 스캔을 가능으로이 속성은 매우 중요한 생화학 적 도구입니다. 우리는 반응 AZI가 UAA, AZF의 다양성에 특별히 초점을 맞춘다부분을​​. ⁹ AZF 또한 인접 급 아민 또는 지방족 수소와 반응시켜 광활성 가교제로 사용될 수 고유의 적외선 (IR) 조사, ^08로서 외에도. 또한, 생물학적으로 불활성 인 아지 도기는 bioorthogonal 라벨링 반응에서 선택적 화학 핸들로서 참여할 수있다. 여기에서 우리는 같은 함정을 대상으로 광 가교 수용체 – 리간드 복합체 및 bioorthogonal 에피토프 태그 형광 라벨 전략으로의 GPCR의 변경 등의 GPCR로 AZF의 사이트 별 법인의 유용한 응용 프로그램을 설명하는 예를 제시한다.

광활성 시약은 1960 년대 이후 생물 학적 시스템을 연구하는 데 사용되었습니다.이 기간에 ^10, 수용체 – 리간드 가교 실험의 풍부가 GPCR 복합체를 연구보고되고있다, 그 중 대부분은 photoaffinity 리간드의 사용을 포함. ^{(11, 12)} 그러나 이러한 그들은 요하는대로 응용 프로그램은 기술적으로 제한됩니다가교기를 함유 리간드의 전자 합성. ^13-15 또한, 리간드의 가교제 잔기, 그것은 GPCR에 가교 결합의 위치를 식별하기 위해 도전. 사이트 구체적 진압 기술 코돈 황색하여 단백질로 UAAs 등 광 가교기를 도입하는 것은 귀중한 발전이다. ^16,17 우리에서 수용체 – 리간드 복합체의 형성에 관여하는 수용체에 결합 인터페이스를 식별하는 광 가교 기법을 개발 GPCR에로 광 불안정성 그룹을 도입함으로써 세포를 살아. ^{(18, 19)} 여기에서 우리는 작은 분자 리간드의 결합 부위, CCR5에 삼중 마라 비록을 식별하기 위해 표적 광 가교 기술을 적용하기위한 실험 프로토콜 및 데이터 분석 방법을 서술. 이 방법은 리간드의 기본 화학 구조를 유지 이외에 방사성 리간드에 손잡이의 정확한 정량화에 대문자.

형광 기반 기술을 직접 수용체의 구조적 상태를 프로빙하여 수용체 활성화의 구조 기준의 정확한 이해를 지원합니다. ^{(20), (21)는} 그러나 GPCR에에 형광 라벨을 소개 할 수있는 유연성을 가진 기술이 사이트 구체적으로 제한됩니다. 우리는 GPCR 신호 복합체의 단일 분자 검출 (SMD)를 용이하게하기 위해 bioorthogonal 화학적 변형 전략을 채용에 관심이 있습니다. ²² 아지 도기는 딩거 (Staudinger) – BERTOZZI ^{내고, 23, 24} 동계 변형 승진 아 지드 – 같은 bioorthogonal 화학에 참여할 수 알킨 사이클로 (SpAAC) ²⁵ 구리 – 촉매 아 지드 – 알킨 사이클로 (CuAAC가). ²⁶ 우리는 아 지드와 포스의 특정 반응을 포함 딩거 (Staudinger) – BERTOZZI 결찰 반응에 초점을 맞춘다. 우리는 펩티드 에피토프 (FLAG 펩티드) 또는 형광 라벨에 접합 된 두 개의 다른 포스 핀 유도체의 사용을 보여GPCR에의 특정 사이트 변경을 달성하기 위해 (형광).

우리는 이전에 노출 된 용매이다 대상 사이트를 선택하는 X-선 결정 구조 및 동적 시뮬레이션을 사용 AZF 변이체 로돕신의 부위 특이 적 표지에 대한 조건을 최적화. ^{27, 28 우리는} 또한 의해 배경 프리 라벨링을 달성하기위한 가능성 도시 딩거 (Staudinger)을 BERTOZZI 결찰. ^{29 우리는} 여기에 면역 매트릭스에 고정하고 이후에 겔 형광에 의해 가시화되는 세제 용해 수용체의 형광 라벨을 달성하기 위해 사용되는 일반적인 과정을 보여줍니다. 또한, 우리는 알 수없는 구조, CCR5의 수용체에 대한 표시 의무가 위치를 식별하기 위해이 라벨 전략에 대한 편리한 확장을 보여줍니다. 이것은 AZF – GPCR은 세포 기반의 세미 높은 처리량 형식으로 변형 bioorthogonal 수정에 의존하는 대상 펩티드 에피토프 태그 전략을 사용하여 수행됩니다. ^(30)이방법은 라벨링 이벤트를 모니터하는 세포 표면 ELISA의 다단계 검출 특성을 이용한다.

우리가 여기서 논의 방법은 일반이며, 원칙적으로 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 AZF로 통합 된 모든 GPCR에 적용 할 수 있습니다. 우리는 세부 사항의 GPCR의 구조와 역동적 인 연구를 용이하게하기 위해 부 자연스러운 아미노산 돌연변이 유발 방법과 그 이후의 응용 프로그램을 사용하여 같은 AZF 등 UAAs와 결합 수용체의 포유 동물 세포 발현하는 단계에서 제시하는 프로토콜에서.

Protocol

1. GPCR에에 부 자연스러운 아미노산의 사이트 별 유전 설립 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 (포도당 4.5 g / L, 2 mM의 글루타민)을 유지한다. 리포 펙 타민 플러스 시약을 사용하여 10-cm 접시에서 60-80% 합류로 성장 된 세포를 형질. 750 μL의 DMEM에, 원하는 위치에 황색 정지 코돈을 포함하는 10 ㎕의 플러스 시약, GPCR의 cDNA 3.5…

Representative Results

우리는 – 특히 사이트 억제 기술 코돈 호박을 사용하여 GPCR에 분자 프로브를 소개하는 부 자연스러운 아미노산 돌연변이 유발 방법을 채택했다. 그림 1의 방식은 방법론의 돌출 단계와의 GPCR에, 다양한 UAA를, P-아지도-L-페닐알라닌 (AZF) 통합의 다양한 응용 프로그램을 설명합니다. 포유 동물 세포에 AZF – GPCR에의 발현은 리간드 광 가교를 대상으로하고, bioorthogonal 라벨 화학을 …

Discussion

우리의 GPCR에, 반응 조사, AZF의 사이트 별 편입 여기 강력한 방법을 설명하고의 GPCR의 구조와 역학을 연구하는이 도구의 세 가지 유용한 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리의 방법이 사이트는, 구체적으로 UAAs 화학적 ^{(32, 33)를} 라벨 또는 단일 접근 시스테인 돌연변이에 photocrosslinkers ^{34 부착에} 따라 다른 전략에 근본적인 문제를 우회 통합. 시스테인 티올 그룹을 대상으로 화학 형광…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials