Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком
Summary
Мы генетически кодирования искусственную аминокислоту, р-азидо-L-фенилаланина в различных целевых позиций в GPCRs и показать универсальность азидогруппы в различных приложениях. Они включают в себя целевой фотосшивки технологии для выявления остатков в лиганд-связывающего кармана GPCR и по конкретным участкам bioorthogonal модификацию GPCRs с пептид-эпитопной меткой или флуоресцентного зонда.
Abstract
Для облегчения структурные и динамические исследования G-белками рецепторы (GPCR) комплексы сигнализации, необходимы новые подходы ввести информативные зондов или наклейки в выраженных рецепторов, которые не нарушают функции рецептора. Мы использовали технологию подавления кодон янтарный генетически-кодирования искусственную аминокислоту, п-азидо-L-фенилаланин (AZF) в различных целевых позиций в GPCRs гетерологично выраженных в клетках млекопитающих. Универсальность азидогруппы иллюстрируется здесь в различных приложениях для изучения GPCRs на родном клеточной среде или под моющих солюбилизированных условиях. Во-первых, демонстрируют на основе клеток целевой фотосшивки технологию для идентификации остатков в лиганд-связывающего кармана GPCR где лиганд малые молекулы меченный тритием сшивают с генетически закодированного азидо аминокислоты. Затем мы продемонстрировать конкретным участкам модификацию GPCRs по bioorthogonal Штаудингера Bertozzi перевязки реакцийТион, что цели азидогруппы использованием производных фосфина. Мы обсуждаем общую стратегию для целевой пептид-эпитопной мечения выраженных мембранных белков в-культуры и ее обнаружения с помощью цельноклеточная подхода, основанного ELISA. Наконец, мы покажем, что AZF-GPCRs могут быть выборочно помечены флуоресцентных зондов. Методики, рассмотренные в целом, в том, что они в принципе может быть применен к любой аминокислотной позиции в любой выражена GPCR чтобы опросить активные комплексы сигнализации.
Introduction
Heptahelical G-белком рецепторы (GPCR) содержат суперсемейство очень динамичных мембранных белков, которые обеспечивают важные и разнообразные внеклеточные сигналы. В классической парадигмы, активация рецептора в сочетании с лиганд-индуцированной конформационных изменений. 1, 2 Последние достижения в области структурной биологии GPCRs оказали значительную представление о молекулярных механизмах трансмембранного сигнализации. 3-5 Однако, чтобы понять с большей химической точностью в функциональный механизм и структурная динамика сигнализации GPCR, инструментарий подходов требуется включить информативные молекулярные и химические исследования, чтобы допросить активные комплексы сигнализации.
С этой целью, мы адаптировали метод к сайт-специфически ввести не-или минимально возмущающие зонды в выраженных рецепторов на основе неестественной аминокислоты (UAA) мутагенеза с использованием янтаря кодон технологией подавления ранее пионером Шульц и сoworkers. 6 Мы оптимизировали методологию мутагенеза UAA для достижения выражение высокодоходным и системы мутагенеза для белков, таких как GPCRs, которые трудно выразить в другие, чем клетки млекопитающих наиболее гетерологичные системы. Использование ортогональной инженерии супрессорной тРНК и развивались аминоацил-тРНК синтетазы пару для конкретного UAA, мы сайт-специфически введены УААН в выраженных целевых GPCRs. Успешное включение УААН, п-ацетил-L-фенилаланин (ACF), п-бензоил-L-фенилаланин (БЗФ) и п-азидо-L-фенилаланин (AZF) была продемонстрирована в наших модельных GPCRs – родопсина и человеческий CC хемокинов, CCR5. 7, 8
В принципе, UAA могут быть генетически закодированы в любой позиции внутри белковой последовательности, и это свойство является бесценным биохимический инструмент, поскольку позволяет одним кодонов сканирование целевой GPCR. Мы сосредоточимся именно на универсальность UAA, AZF, которая имеет реактивный Aziсделать группировку. В дополнение к действующей в качестве уникального инфракрасного (ИК) датчика, 8, 9 AZF также может служить в качестве Фотоактивируемые сшивающего агента путем взаимодействия с соседними первичных аминов или алифатических атомов водорода. Кроме того, биологически инертным азидо-группа может участвовать в качестве селективного химического ручкой в bioorthogonal реакций маркировки. Здесь мы представляем примеры, иллюстрирующие полезные применения конкретных участков включения AZF в GPCRs, таких как целевой фотосшиванию ловушку в рецептор-лиганд, и модификации GPCRs по bioorthogonal эпитопной пометки и люминесцентных стратегий маркировки.
Фотоактивируемые реагенты были использованы для изучения биологических систем с 1960 года. 10 В этот период, обилие рецептор-лиганд экспериментов сшивания были зарегистрированы для изучения GPCR комплексы, большинство из которых связано с использованием фотоаффинное лигандов. 11, 12 Однако эти приложений технически ограничено, так как они Requirэ синтез лигандов, несущих сшивания группу. 13-15 Кроме того, с сшивателя фрагмента в лиганда, это сложно определить местоположение пантографа на GPCR. Сайт-специфически введения фотосшивки группы, как УААН в белки с использованием кодонов желтым технологии подавления является ценным продвижение. 16, 17 Мы разработали методику фотосшивки, чтобы определить интерфейс на связывание с рецептором, который участвует в формировании рецептор-лиганд в живых клеток путем введения фотолабильных групп в GPCRs. 18, 19 Здесь мы описываем экспериментальный протокол и способ анализа данных для применения этого целевого технологии фотосшивки идентифицировать сайт связывания лиганда с малой молекулой, меченного тритием маравирок, на CCR5. Этот способ использует преимущества точного количественного определения радиоактивного ручкой на лигандом, в дополнение к сохранению родной химическую структуру лиганда.
Методы флуоресценции основе поддерживать точное понимание структурной основе активации рецептора непосредственно зондирования конформационное состояние рецептора. 20, 21 Однако, методы, обладающие гибкостью ввести флуоресцентные метки в GPCRs сайт-специфически ограничены. Мы заинтересованы в привлечении bioorthogonal стратегии химической модификации для облегчения обнаружения одиночных молекул (SMD) из GPCR сигнализации комплексов. 22 азидогруппу могут участвовать в bioorthogonal химии, таких как Штаудингера Bertozzi перевязки, 23, 24 меди без деформации раскрученной азида- алкин циклоприсоединение (SpAAC) 25 и медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединение (CuAAC). 26 Мы сосредоточимся на перевязки реакции Штаудингера Bertozzi который включает в себя специфическую реакцию между азида и фосфина. Показано, использование двух различных производных фосфин, конъюгированный с эпитопом пептида FLAG (пептид) или флуоресцентной меткой(Флуоресцеина) для достижения конкретного участка модификацию GPCRs.
Мы ранее Оптимизированы условия по конкретным участкам маркировки родопсина AZF варианты с использованием рентгеновской кристаллическую структуру и динамическое моделирование выбрать целевые сайты, которые растворителя подвергается. 27, 28 Мы также проиллюстрировал возможности для достижения фона без маркировки на Staudinger- Bertozzi лигирование. 29 Покажем здесь общей процедуре, используемой для достижения флуоресцентного мечения моющей-солюбилизированного рецептора, который иммобилизован на иммуноаффинной матрицы, а затем визуализировали с помощью флуоресценции в геле. Кроме того, мы демонстрируем полезное расширение на этой маркировки стратегии выявления позиции поддающиеся маркировки на рецептором неизвестной структуры, CCR5. Это осуществляется с помощью целевой мечения стратегию пептид-антигенной детерминанты, которая опирается на bioorthogonal модификации вариантов AZF-ХВГФ в формате полу-высокой пропускной основе клеток. 30 ЭтоМетод основан на использовании свойств обнаружения многоступенчатой из клеточной поверхности ELISA для контроля маркировки события.
Методологии мы обсуждаем здесь носят общий характер и в принципе может быть применен к любой GPCR объединена с AZF помощью янтаря кодонов технологией подавления. В протоколах, представленных здесь мы подробно шаги, участвующие в млекопитающих выражения клеток рецепторов, включенных с УААН, таких как AZF использованием неестественный метод мутагенеза аминокислот и их последующие заявки для облегчения структурные и динамические исследования GPCRs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем здесь четкой методологии для конкретных участков включения реактивного зонда, AZF, в GPCRs и продемонстрировать три полезные применения этого инструмента для изучения структуры и динамики GPCRs. Наш метод на сайт-специфически включить УААН обходит фундаментальную проблему с а?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим щедрую поддержку нескольких фондов и благотворительных доноров (см. SakmarLab.org).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| [header] | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| [header] | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| [header] | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. 생화학. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. 생화학. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. 생화학. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. 생화학. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. 생화학. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. 생화학. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
