Genetiskt kodade molekylära sonder för att studera G-proteinkopplade receptorer

Summary

Vi genetiskt koda den onaturliga aminosyror, p-azido-L-fenylalanin vid olika riktade positioner i GPCRs och visar mångsidigheten hos azidogrupp i olika applikationer. Dessa inkluderar en riktad fototvär teknik för att identifiera rester i den ligandbindande fickan hos en GPCR, och sätesspecifik bioorthogonal modifiering av GPCR: er med en peptid-epitop-tag eller fluorescerande sond.

Abstract

För att underlätta strukturell och dynamiska studier av G-proteinkopplad receptor (GPCR) signaleringskomplex, är nya metoder som krävs för att införa informations prober eller etiketter i uttryckta receptorer som inte perturb receptorfunktion. Vi använde amber kodon undertryckande teknik för att genetiskt koda den onaturliga aminosyror, p-azido-L-fenylalanin (AZF) vid olika riktade positioner i GPCRs heterologt uttryckta i däggdjursceller. Mångsidigheten azidogruppen illustreras här i olika applikationer för att studera GPCRs i deras naturliga cellulära miljö eller under tvätt-och rengöringsmedel upplösta förhållanden. Först visar vi en cellbaserad riktad fototvär teknik för att identifiera rester i ligand-bindande fickan på GPCR där en tritiummärkt småmolekylära ligand tvärbunden till en genetiskt kodad azido aminosyra. Vi visar sedan platsspecifik modifiering av GPCRs av bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaktionning som riktar azidogruppen använda fosfin derivat. Vi diskuterar en allmän strategi för riktade peptid-epitop taggning av uttryckta membranproteiner i-kulturen och dess upptäckt med hjälp av en hel-cell-baserade ELISA-metod. Slutligen visar vi att AZF-GPCR kan selektivt märkta med fluorescerande prober. De metoder som diskuteras är generella, i det att de kan i princip tillämpas på alla aminosyrapositionen i någon uttryckte GPCR att förhöra aktiva signaleringskomplex.

Introduction

Heptahelical G-proteinkopplade receptorer (GPCR) innefattar en superfamilj av högdynamiska membranproteiner som förmedlar viktiga och olikartade extracellulära signaler. I den klassiska paradigmet, är receptoraktivering i kombination med ligandinducerade konformationsförändringar. ^1, har ² Nya framsteg inom strukturbiologi av GPCRs förutsatt betydande insikt i de molekylära mekanismerna för trans signalering. ^3-5 Men för att förstå med ökad kemisk precision funktionell mekanism och strukturdynamik av GPCR signalering, är en verktygslåda med metoder som krävs för att införliva informativa molekylära och kemiska sonder för att förhöra aktiva signaleringskomplex.

För detta ändamål anpassade vi en metod för att sätesspecifikt införa icke-eller minimalt störande prober in uttryckta receptorer baserade på onaturlig aminosyra (UAA) mutagenes med användning amber kodon undertryckande teknik tidigare uppfunnen av Schultz och coworkers. ⁶ Vi optimerat UAA mutagenes metod för att uppnå en hög avkastning uttryck och mutagenes system för proteiner såsom GPCRs, som är svåra att uttrycka i andra än däggdjursceller mest heterologa system. Med hjälp av en ortogonal konstruerad suppressor tRNA och utvecklats aminoacyl-tRNA-syntetas paret för en specifik UAA, vi platsspecifikt infört UAAs i uttryckta mål GPCRs. Den framgångsrika inkorporeringen av UAAs, p-acetyl-L-fenylalanin (ACF), p-bensoyl-L-fenylalanin (BZF), och p-azido-L-fenylalanin (AZF) har visats i våra modell GPCRs – rhodopsin och humant CC kemokinreceptorn, CCR5. ^{7, 8}

I princip kan en UAA vara genetiskt kodade vid någon position inom proteinsekvensen och den här egenskapen är ett ovärderligt biokemiska verktyg eftersom det möjliggör enkel-kodon skanning av ett mål GPCR. Vi fokuserar här på just mångsidigheten hos UAA, AZF, som har en reaktiv azido-delen. Förutom att fungera som en unik infraröd (IR) sond, ^{8, 9} AZF kan också fungera som ett fotoaktiverbart tvärbindningsmedel genom att reagera med de angränsande primära aminer eller alifatiska väten. Dessutom kan biologiskt inert azidogrupp delta som ett selektivt kemiskt handtag i bioorthogonal märkningsreaktioner. Här presenterar vi exempel som illustrerar de användbara tillämpningar av platsspecifik inkorporering av AZF i GPCRs, såsom riktad fototvär att fånga en receptor-ligand-komplex, och modifiering av GPCRs genom bioorthogonal epitop taggning och fluorescerande strategier märkning.

Fotoaktiverbara reagens har använts för att studera biologiska system sedan 1960-talet. ¹⁰ Under denna period har ett överflöd av receptor-ligand tvärbindningsförsök rapporterats att studera GPCR komplex, deltar de flesta av vilka användningen av fotoaffinitetsligander. ^{11, 12} Men dessa applikationer är tekniskt begränsade, eftersom de kräe syntes av ligander som bär en tvärbindningsgrupp. ^13-15 Dessutom med tvärbinddelen i liganden, det är svårt att identifiera platsen för tvärbindning på GPCR. Platsspecifikt införande av fototvär grupper som UAAs i proteiner med användning av den gula kodonet undertryckande teknologi är ett värdefullt framsteg. ^{16, 17} Vi utvecklade en fototvär teknik för att identifiera det bindande gränssnittet på en receptor som är involverad i bildningen av ett receptor-ligand-komplex i levande celler genom införande av fotolabila grupper till GPCR. ^{18, 19} Här beskriver vi den experimentella protokollet och metod för dataanalys för att tillämpa denna riktad fototvär teknik för att identifiera bindningsstället av en liten molekyl liganden tritierad maravirok å CCR5. Metoden drar nytta av exakt kvantifiering av den radioaktiva handtaget på liganden, förutom att behålla den nativa kemiska strukturen av liganden.

Fluorescensbaserade tekniker stöder exakt förståelse för den strukturella basen av receptoraktivering genom att direkt sondera konformationstillstånd av receptorn. ^{20, 21} emellertid, tekniker som har den flexibiliteten att införa fluorescerande markörer i GPCRs platsspecifikt är begränsade. Vi är intresserade av att anställa bioorthogonal kemisk modifiering strategier för att underlätta enda molekyl upptäckt (SMD) i GPCR signalering komplex. ²² azidogruppen kan delta i bioorthogonal kemiska sammansättningar såsom Staudinger-Bertozzi ligation, ^{23, 24} koppar-fri stam-främjade azid- alkyn cykloadditionen (SpAAC) ²⁵ och koppar-katalyseras azid-alkyn cykloadditionen (CuAAC). ²⁶ Vi fokuserar här på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktion som involverar den specifika reaktionen mellan en azid och en fosfin. Vi visar användningen av två olika fosfin-derivat, konjugerade till en peptid-epitop (FLAG-peptid) eller en fluorescerande märkning(Fluorescein) för att uppnå platsspecifik modifiering av GPCR.

Vi har tidigare optimerat förutsättningarna för platsspecifik märkning av rhodopsin AZF varianter med hjälp av röntgenkristallstruktur och dynamiska simuleringar för att välja mål webbplatser som är lösningsmedels utsatta. ^{27, 28} Vi illustrerade också möjligheten att nå bakgrundsfria märkning av Staudinger- Bertozzi ligering. ²⁹ Vi visar här av den vanliga proceduren för att uppnå fluorescensmärkning av en detergent-solubiliserat receptor som är immobiliserad på en immunaffinitetsmatris och därefter visualiseras genom in-gel-fluorescens. Dessutom visar vi en bra förlängning på denna märkning strategi för att identifiera positioner bli föremål för märkning på en receptor av okänd struktur, CCR5. Detta sker med hjälp av en riktad peptid-epitop tagg strategi som bygger på bioorthogonal modifiering av AZF-GPCR varianter i ett cellbaserat halv hög genomströmning format. ³⁰ DettaMetoden utnyttjar flerstegsdetekteringsegenskaperna hos en cellyt-ELISA för att övervaka märkningshändelser.

De metoder som vi diskuterar här är generella och i princip kan tillämpas på alla GPCR införlivas med AZF hjälp av amber kodon dämpning teknik. I de protokoll som presenteras här vi i detalj de steg som ingår i däggdjurscelluttryck av receptorer införlivas med UAAs såsom AZF med hjälp av onaturliga aminosyror mutagenes metod och deras efterföljande ansökningar för att underlätta strukturella och dynamiska studier av GPCRs.

Protocol

1. Platsspecifik Genetisk Införande av onaturliga aminosyror i GPCRs Bibehåll HEK293T-celler i DMEM (4,5 g / l glukos, 2 mM glutamin) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. Transfektera cellerna odlas till 60-80% sammanflödet i en 10 cm platta med hjälp av Lipofectamine Plus-reagens. Till 750 | il DMEM, tillsätt 10 | il Plus-reagens, 3,5 | ig av GPCR-cDNA (pMT4. Rho eller pcDNA 3,1. CCR5) innehållande den amber-stoppkodon vid en ö…

Representative Results

Vi använde onaturliga aminosyror mutagenes metod för att platsspecifikt introducera molekylära sonder till en GPCR med hjälp av amber kodon dämpning teknik. Systemet i Figur 1 visar de framträdande stegen i metoden och de olika tillämpningar av att införliva det mångsidiga UAA, p-azido-L-fenylalanin (AZF), i GPCRs. Uttryck av AZF-GPCR i däggdjursceller möjliggör riktade fototvär till ligander, och riktade peptid-epitop märkning eller fluorescerande ändringar i GPCR via b…

Discussion

Vi beskriver här en lämplig metod för platsspecifik inkorporering av en reaktiv sond, AZF, i GPCRs och demonstrera tre användbara tillämpningar av detta verktyg för att studera struktur och dynamik av GPCRs. Vår metod för att platsspecifikt införliva UAAs kringgår ett grundläggande problem med en alternativ strategi som bygger på kemisk märkning ^{32, 33} eller fästa fototvärbindare ³⁴ till en enda tillgänglig cystein mutant. Även kemier som riktar cystein tiolgrupper har använts fö…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS for azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position
HEK 293T cells			Adherent cells
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco	10566
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials
			[header]
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF is activated by 365-nm light
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovine serum albumin	Roche	3117405001
Tritium-labeled ligand			From collaborator (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Trans-Blot SD apparatus	Biorad		Apparatus for semi-dry transfer
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Millipore	IPVH00010
Non-fat powered milk	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillation fluid
Scintillation vials	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter	Perkin Elmer		Beta-Scintillation counter
Anti-rhodopsin 1D4 mAb	National Cell Culture Center	custom
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Table 2. Targeted photocrosslinking materials
			[header]
0.25% Trypsin	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylphosphine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Clear bottom, high binding EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyde	EMS	28908
HRP-conjugated	KPL, Inc.	474-1516
anti-rabbit IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Hydrogen peroxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials
			[header]
Fluorescein-phosphine			(Huber et al., submitted 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner	GE Healthcare	discontinued	Scanner with 488-nm wavelength laser
			Table 4. Fluorescent labeling materials