Archival formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) kliniske prøver er verdifullt materiale for undersøkelse av sykdommer. Her viser vi en prøveopparbeidelse arbeidsflyt slik i dybden proteomikk analyser av microdissected FFPE vev.
Bevarte klinisk materiale er en unik kilde for proteomikk etterforskning av menneskelige lidelser. Her beskriver vi en optimalisert protokollen tillater storskala kvantitativ analyse av formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) vev. Prosedyren består av fire forskjellige trinn. Den første er utarbeidelsen av seksjoner fra FFPE materiale og microdissection av celler av interesse. I det andre trinn de isolerte celler blir lysert, og behandlet ved hjelp av (FASP) teknikken "filter styrt prøvepreparering '. I dette trinnet blir proteiner utarmet fra reagenser anvendt for prøven lyse og oppsluttes i to trinn ved bruk av endoproteinase LysC og trypsin.
Etter hver fordøyelsen, er peptidene som samles i adskilte fraksjoner og deres innhold som bestemmes ved hjelp av en meget følsom fluorescens-måling. Endelig er de peptider fraksjonert på 'pipette-tip' microcolumns. De LysC-peptider er delt inn i fire fraksjoner mens tryptiske peptides er delt inn i to fraksjoner. På denne måte fremstilte prøver tillate analyse av proteomes av små mengder av materialet til en dybde på 10.000 proteiner. Således er den beskrevne arbeidsflyten en kraftfull teknikk for å studere sykdommer hos en systemomfattende-måte, så vel som for identifisering av potensielle biomarkører og narkotika mål.
Feste med paraformaldehyde og innstøping i parafin (FFPE) er standard metode for konservering og pathomorphologic etterforskning av klinisk vev materiale. Mikroskopi av bevart vev tillater identifisering av sykdomsrelaterte morfologiske endringer, og påvisning og scoring av forekomsten av sykdomsrelaterte antigener. Siden vanligvis bare en liten del av den FFPE prøven blir brukt i disse analysene, store mengder av klinisk materiale forblir arkivert og kan utnyttes i andre typer studier.
Under det siste tiåret forskning innen life sciences har blitt styrket av den kraftige proteomikk teknologi. Denne teknologien gjør det mulig for identifisering og kvantifisering av tusenvis av proteiner i komplekse proteinblandinger. Et viktig trekk ved den teknologi er at bare små mengder av materiale som er nødvendig for storskala-analyser. Nyere proteomikk studier vist at proteiner kan studeres på en skala fra nesten kompLete proteomes 1, 2. Slike undersøkelser kan hele systemet innsikt i sammensetningen av cellene og identifisering av grupper av proteiner som forekommer ved avvikende nivåer i sykdommer. Mens disse studiene krevde store massespektrometri kapasiteter, har den siste arbeid vist at tilsvarende grad av identifisering kan oppnås innenfor en enkelt dag måle tre.
Kravet til relativt lav sample beløp og den store tilgjengeligheten av de bevarte kliniske prøver fristet oss og andre for å utvikle metoder slik at proteomikk utforskning av FFPE materiale (for en gjennomgang se 4). Å dra nytte av reversibilitet av formalin fiksering under en varmebehandling vi har utviklet en protokoll som tillater kvantitativ ekstraksjon av proteiner fra fast vev fem. Vi har vist at festemåten bevarer ikke bare proteiner, men også i det minste noen posttranslational modifikasjoner. Fosfatorylation og N-glykosylering kan studeres ved hjelp av FFPE 5, men en forutsetning for det er en grundig kontrollert vev innsamling, lagring og festeforhold. Deretter har vi optimalisert fremgangsmåte for en laser-fangst mikrodisseksjon av det faste vev og for proteomikk reaktoren baserte prøvebehandling 6, 7. En stor skala studie på tykktarmskreft tillatt kvantitativ analyse av 7500 proteiner fra microdissected fra klinisk materiale åtte. Endelig har vi forbedret veien for utforskning av microdissected materialet ved å bruke rad-to trinn protein fordøyelse protokoll 9. I sammenligning med de vanlige fordøyelse ved hjelp av strategier enkelt enzym, gjør denne fremgangsmåten generering av flere sekvensavhengige peptider, og følgelig resulterer i en større dybde av protein identifikasjon. Analyse av microdissected menneskelig adenom tillatt proteomikk analyser til en dybde på 9500 proteiner per prøve tre. I denne study vi kartlagt 55000 peptider per prøve slik at identifisering av 88-89% proteiner med minst to peptider. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for preparering av prøver fra FFPE materialet for LC-MS/MS analyse. Denne protokollen omfatter utarbeidelse av vev skiver for microdissection, lyse av de isolerte celler, og utvalgets behandling i en reaktor format (FASP) 6. Deretter vi beskrive en spektrofluorometriske bestemmelse av peptid utbytter, en aktivitet med høy viktighet for optimal peptid identifisering av massespektrometri. Til slutt viser vi en sterk anionbytter (SAX) basert separasjonsteknikk for peptid fraksjonering. I denne fremgangsmåten både peptidet separasjon og Sluttrengjoering blir utført ved hjelp av pipette-spissen microcolumns 10, 11. Dette trinnet er valgfritt, men anbefales i studier der mer enn noen få mikrogram peptider kan fås fra en enkelt prøve. Den SAX-fraksjonering kan øke antallet og dynamisk spekter av identfikasjoner og forlenge proteinsekvens dekning 3, 10.
Muligheten til å studere FFPE materiale av proteomikk teknologi til en dybde sammenlignbar med nukleinsyre sekvensering og microarray teknikker åpner nye perspektiver i biomarkør og narkotika target oppdagelse. Den beskrevne protokollen gjør det mulig karakterisering og kvantifisering av proteomes av populasjoner av microdissected celler på en skala fra 10.000 proteiner. Ved bruk av mindre av den microdissected materiale et mindre datasett kan genereres, men kanskje i mange tilfeller de kan også gi verdifulle kliniske data. Således kan enten prøvene analyseres direkte etter MED-FASP prosedyre eller kan separeres i mindre fraksjoner. Siden FASP prosedyren er kompatibelt med hvilken som helst type protease, kan andre enzymer eller deres kombinasjon brukes fra protein digestions 6.
Kvaliteten på FFPE materialet synes å være den mest kritiske utgave av analysen. Vi har opplevd at den faste vev av samme opprinnelse, men kommer fra forskjelligent klinikker hadde distinkte egenskaper. Ved å bruke vev fra en kilde var vi i stand til å generere peptider i høyt utbytte, mens det liknende materiale fra et annet klinikken var nesten ubrukelig. Det er sannsynlig at den anvendte fiksering og integreringsfremgangsmåter, så vel som lagringsbetingelser er de viktigste faktorer som påvirker egenskapene til det kliniske materialet 12. Derfor er det lurt å teste egenskapene til noen prøver før du starter et større prosjekt.
Mange publikasjoner rapportert bruken av FFPE materialet i det siste. Men antall proteiner identifisert i disse studiene oversteg aldri mer enn 1000-2000 proteiner fire. Tatt i betraktning av størrelsen av de humane cellespesifikke proteomes som består av mer enn 10.000 proteiner, slike studier var i stand til bare å gi en meget overfladisk bilde, nesten begrenset til meget rikelig proteiner involvert i dag funksjoner. Vår protokollen muliggjør effektiv isolering av klinisk eller biologisk materiale from konservert vev, og er optimalisert for lysering, proteinprosessering og peptid prefraksjonering. Som en konsekvens vår prøvepreparering arbeidsflyt, når den er koblet til det avanserte massespektrometri, tillater innsikt i en nesten fullstendig proteomes. Bemerkelsesverdig, er dette mulig på minuttet prøven beløpskrav.
Den store fordelen med å bruke de bevarte vev er deres relative bred tilgjengelighet. FFPE arkivert i mange år og tiår, og noen ganger ansett som ubrukelig, nå, takket være proteomikk teknologi, fremstår som svært verdifullt materiale for klinisk forskning. Mens mange sykdommer kan studeres ved hjelp av fersk eller frosset materiale undersøkelse av FFPE materiale synes å være spesielt viktig for å studere sjeldne sykdommer 12, var samling av et representativt sett av prøven tar vanligvis lang tid.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren takket Dr. Matthias Mann for kontinuerlig støtte og Mrs. Katharina Zettl for å demonstrere metoden.
Dette arbeidet ble støttet av Max-Planck Society for Advancement of Science.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
MembraneSlide 1.0 PEN | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9041-000 | |
Adhesive Cap 200 opaque | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9181-000 | |
Mayer’s hematoxylin solution | Sigma-Aldrich St. Louis, MO | MHS32 | |
Forensic 30k | Merck Millipore Darmstadt, Germany | MRCF0R030 | (Previously sold as Microcon YM-30) |
Empore Anion | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2252 | |
Empore C18 | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2215 | |
Trypsin | Promega | 2014-06-27 | |
Endoproteinase Lys-C | Wako | 129-02541 |