زرع الخلايا الشمية مغمد لتقييم الانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب المحيطي
Summary
الخلايا الشمية مغمد (الكاريبي) هي خلايا قمة العصبية التي تسمح نمو الخلايا العصبية الشمية الأولية. هذه الخاصية محددة يمكن استخدامها لزرع الخلايا. نقدم هنا نموذجا لزرع خلوية تعمل على أساس استخدام الكاريبي في العصب نموذج إصابة الحنجرة.
Abstract
الخلايا الشمية مغمد (الكاريبي) هي الخلايا العصبية التي تتيح قمة النمو وإعادة نمو الخلايا العصبية الشمية الأولية. في الواقع، يتميز نظام حاسة الشم الأولية من خلال قدرتها على أن تؤدي إلى خلايا عصبية جديدة حتى في الحيوانات البالغة. ويعزى ذلك جزئيا إلى وجود منظمة دول شرق الكاريبي الذي خلق المكروية مواتية لتكوين الخلايا العصبية هذه القدرة خاصة. وقد استخدم هذا العقار لمنظمة دول شرق الكاريبي لزرع الخلايا كما هو الحال في نماذج إصابات الحبل الشوكي. على الرغم من أن الجهاز العصبي المحيطي لديه قدرة أكبر على التجدد بعد إصابة العصب من الجهاز العصبي المركزي، أقسام كاملة لحث misrouting خلال إعادة نمو محور عصبي ولا سيما بعد الوجه من الحنجرة transection العصب. على وجه التحديد، باجتزاء الكامل للعصب الحنجري الراجع (RLN) يدفع إعادة نمو محور عصبي الشاذة الناتجة في حركة تصاحبية من الحبال الصوتية. ، أظهرنا في هذا النموذج المحدد الذي زرع الكاريبي يزيد كفاءة محور عصبي إعادة النمو.
وتشكل ve_content "> منظمة دول شرق الكاريبي من عدة مجموعات سكانية فرعية موجودة في كل من الغشاء المخاطي الشمي (OM-الكاريبي) وبصيلات الشم (OB-الكاريبي)، ونحن نقدم هنا نموذجا لزرع خلوية تعمل على أساس استخدام هذه المجموعات السكانية الفرعية المختلفة في منظمة دول شرق الكاريبي RLN نموذج الاصابة. باستخدام هذا النموذج، تم زرع الثقافات الأولية من OB-الكاريبي ومنظمة دول شرق الكاريبي في OM-Matrigel بعد القسم ومفاغرة من RLN. وبعد شهرين من الجراحة، قمنا بتقييم الحيوانات زرعها بواسطة التحليلات التكميلية على أساس videolaryngoscopy، الكهربائي (EMG) ، والدراسات النسيجية. أولا، يسمح videolaryngoscopy لنا لتقييم وظائف الحنجرة، ولا سيما cocontractions العضلات الظواهر، ثم يحلل EMG ثراء شرحها وتزامن الأنشطة العضلات. وأخيرا، سمحت الدراسات النسيجية على أساس طولويدين تلطيخ الأزرق الكمي لعدد والملف الشخصي من ألياف العصبي.كل ذلك معا، ونحن هنا تصف كيفية عزل، والثقافة، وبيئة تطوير متكاملةntify وزرع الكاريبي من OM وOB بعد RLN المقطع مفاغرة وكيفية تقييم وتحليل كفاءة هذه الخلايا التي تم زرعها على إعادة نمو وظائف الحنجرة محور عصبي.
Introduction
ويتكون النظام الأساسي للحاسة الشم قسمين منفصلين؛ الغشاء المخاطي الشمي (OM) في الجهاز العصبي المحيطي والبصلة الشمية (OB) في الجهاز العصبي المركزي. ويتميز نظام حاسة الشم الابتدائي بحلول قدرة الخلايا العصبية الشمية الابتدائي (PON) لتجديد الذاتي في جميع مراحل الحياة في أنواع الثدييات. يرصد هذه القدرة ممكن بسبب وجود الخلايا الجذعية العصبية في OM. ومما يسهل نمو وإعادة نمو PON من OM إلى OB من قبل خلايا متخصصة تسمى الخلايا الدبقية مغمد الشمية (الكاريبي). منظمة دول شرق الكاريبي هي الخلايا العصبية التي تخلق قمة المكروية مواتية لتكوين الخلايا العصبية من PON من OM إلى OB 1. وبالتالي، منظمة دول شرق الكاريبي يمكن العثور عليها في وOM في OB تشكل مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا 2،3. خصائص مختلفة من منظمة دول شرق الكاريبي يكون العلماء الرصاص لاستخدامها لزرع الخلوية في عدة نماذج النظام العصبي الآفة 4. في الواقع، وعوامل نمو إنتاج منظمة دول شرق الكاريبي، والحد من اخافة الدبقية، والعلاقات العامةإعادة نمو محور عصبي omote، ويمكن أن تختلط بحرية مع الخلايا النجمية 5،6. ومع ذلك، تقوم الغالبية العظمى من هذه الدراسات على إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، وقد استخدمت قليل منها منظمة دول شرق الكاريبي بعد إصابة الأعصاب الطرفية (PNI) 7،8.
على الرغم من أن الجهاز العصبي المحيطي لديه قدرة كبيرة على التجدد بعد إصابة العصب، أقسام كاملة لحث الشاذة محور عصبي إعادة النمو. في الواقع، بعد transections كاملة من الوجه أو الأعصاب الحنجري الراجع (RLN) محاور misrouted يعد يسبب cocontractions العضلات تسمى حركة تصاحبية. لذا فإنه من الأهمية الأساسية لاقتراح نموذج للPNI لتحديد ليس فقط إعادة نمو محور عصبي ولكن أيضا لتقييم كفاءة تقلصات العضلات. في الأدب ويستند النموذج الأكثر شيوعا الموصوفة على الوجه الآفة العصب 9،10. في هذا النموذج، وتستند تقييمات وظيفية على الانتعاش من الحركات الطولي 10. ومع ذلك معقد للتدليل على كفاءة وسائل التحققبيانات أدلى وتميز cocontractions الظواهر العضلات. نقترح هنا نموذجا يعتمد على آفة RLN. هذا النموذج يسمح للتقييم ليس فقط إعادة نمو محور عصبي وحركات الحبال الصوتية ولكن أيضا من كفاءة وظيفة هذه الحركات بعد زرع الخلايا 11،12. يوفر هذا البروتوكول خطوة الإجراء خطوة لزرع الثقافة ومنظمة دول شرق الكاريبي من OM وOB في نموذج القسم RLN / مفاغرة وتقييم الحيوانات بعد الجراحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التقنيات المقدمة هنا جعل الكاريبي نموذجا مفيدا لدراسة زرع الخلوية في نماذج إصابة الأعصاب الطرفية. بروتوكول خلية ثقافة واضحة نسبيا ويمكن حملها بسهولة. من ناحية أخرى، والعمليات الجراحية، ولا سيما الفرع / مفاغرة من RLN، تحتاج إلى خبرة ويجب أن تنفذ من قبل موظفين مؤهلين. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه ADIR (معاون à الموطن منتدى قلعة Insuffisants Respiratoires) ومؤسسة DE L'أفينير لدعمها المالي وللدكتور Fanie Barnabé-حيدر لتحرير المخطوطة.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T |
| FBS | Invitrogen | E3387M |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 |
| DDSA | BIOVALLEY | 00563-450 |
| MNA | BIOVALLEY | 00886-450 |
| BDMA | BIOVALLEY | 00141-100 |
| POLYBED 812 | BIOVALLEY | 08791-500 |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 |
| Toluidine Blue | RAL DIAGNOSTICS | 361590-0025 |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK |
| Incubator | Thermo scientific | |
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur |
| Microscope | Zeiss | |
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 |
| Acquisition system | ADInstruments | Powerlab system |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
References
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
