El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped
Summary
Aquí, demostramos cómo citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con células huésped en cultivo. Esta técnica se puede utilizar como una alternativa a la CFU enumeración.
Abstract
Los estudios sobre los mecanismos de la patogénesis celulares de levaduras patógenas tales como Candida albicans, Histoplasma capsulatum y Cryptococcus neoformans emplean comúnmente infección de huéspedes mamíferos o células huésped (es decir, los macrófagos), seguido por la cuantificación de levadura utilizando formadoras de colonias unidad de análisis o la citometría de flujo. Mientras unidad formadora de colonias enumeración ha sido el método más comúnmente utilizado en el campo, esta técnica tiene desventajas y limitaciones, incluyendo el crecimiento lento de algunas especies de hongos en medios sólidos y eficiencias bajas y / o variable de chapado, lo cual es de particular preocupación cuando se comparan el crecimiento de las cepas de tipo salvaje y mutante. La citometría de flujo puede proporcionar una rápida información cuantitativa con respecto a viabilidad de la levadura, sin embargo, la adopción de la detección de citometría de flujo para las levaduras patógenas se ha visto limitado por un número de razones prácticas, incluyendo su alto costo y las consideraciones de seguridad de la biotecnología. Este sentido, demuestran una imagen basada enmetodología de citometría de uso de la Visión Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) para la cuantificación de levaduras patógenas viables en co-cultivo con macrófagos. Nuestros estudios se centran en la detección de dos hongos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum y Candida albicans H.. capsulatum coloniza los macrófagos alveolares mediante la replicación dentro del fagosoma macrófagos, y aquí, nos cuantitativamente evaluar el crecimiento de H. levaduras capsulatum en RAW 264,7 macrófagos con naranja de acridina / tinción con yoduro de propidio en combinación con citometría de imagen. Nuestro método recapitula fielmente las tendencias de crecimiento, medido por unidad formadora de colonia tradicional enumeración, pero con un aumento significativo de sensibilidad. Además, se evalúa directamente la infección de los macrófagos en vivo con una cepa que expresa GFP de C. albicans. Nuestra metodología ofrece un medio rápido, preciso, y económico para la detección y cuantificación de hongos patógenos humanos importantes en asociación ingeniocélulas huésped h.
Introduction
Estudios de hongos patógenos en asociación con sus anfitriones y / o células huésped a menudo requieren la cuantificación de células fúngicas viables durante un transcurso de tiempo o bajo diferentes condiciones de infección. Enumeración de las unidades formadoras de colonias (UFC) es el método estándar por el cual se ha medido el número de células de hongos viables, sin embargo, esta técnica tiene varios inconvenientes y limitaciones. En primer lugar, muchas especies de hongos son de crecimiento lento. El crecimiento de colonias visibles en medios sólidos puede tardar 1-2 semanas, disminuyendo significativamente el ritmo de la investigación. En segundo lugar, la manipulación de las muestras durante chapado UFC es un proceso laborioso, ya que varias diluciones deben ser chapados para asegurar un número contable de colonias. En tercer lugar, el número de UFC es típicamente menor que el número de organismos viables sembradas debido a que la eficiencia de plaqueo es muy por debajo de 100%. Por ejemplo, la eficiencia de la galjanoplastia para el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum patógeno puede ser tan alta como 90%, pero son habitualmente tan bajo como30% y son aún más baja (10%) para el relacionado con hongos dimorfo Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Eficiencia de plaqueo para Candida albicans también está sujeta a la variabilidad 3. Por último, el análisis de CFU representa sólo las células en vivo y dividiendo activamente capaces de establecer el crecimiento en medios sólidos, mientras que en muchas situaciones, sería útil para determinar la presencia y concentración de las células muertas inactivos y / o metabólicamente.
Anteriormente, los métodos de citometría de flujo para la cuantificación de varias especies de hongos patógenos ha sido descrito 4-6. Sin embargo, debido a problemas de contención de bioseguridad relacionados con el uso de bioseguridad de nivel 2 (BSL2) o patógenos BSL3 nivel de citómetros de flujo compartidas, la adopción de esta técnica ha sido limitada. Al igual que la citometría de flujo, citometría de imagen es un método sensible y rápido de cuantificación celular. Sin embargo, la citometría de imagen se puede realizar a una fracción del costo con resultados comparables 7 –11. Aquí, se describen los métodos para realizar citometría de imagen de hongos patógenos en asociación con las células huésped. Demostramos nuestros métodos utilizando dos hongos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum y Candida albicans H.. capsulatum es un hongo patógeno dimórfico que causa la enfermedad de las vías respiratorias, en los seres humanos, que crece como levadura en ciernes y se replica dentro de los macrófagos alveolares Candida albicans es una especie comensal humanos, que en ocasiones causa la candidiasis.. Se demuestra que la citometría de imagen permite una rápida cuantificación de estas levaduras, junto con la capacidad de visualización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citometría de imagen permite al usuario capturar imágenes de alta calidad y el uso de software especializado, realizar una rápida cuantificación de células. Un reto potencial para la adopción de la citometría de imagen en el campo de la patogénesis microbiana es que los microbios a ser contadas están presentes en una población mixta de células, incluyendo las células huésped de mamífero. Aquí, demostramos que la citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de levaduras patógenas viable…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
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