뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.
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방법 논문
실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
뇌 스트로크 미세 아교 세포 / 대 식세포 후 (M / M)가 새로운 표면 항원의 발현 및 축적되어 염증 반응을 유지하는 매개체의 생산을 포함 극적인 형태 및 표현형의 변화와 급속한 활성화를 받고있다. 신흥 증거는 M / M은 급성 뇌 손상 후 클래식 (M1) 염증성 또는 다른 항 염증 (M2) 활성화를 가정 할 수있다 높은 플라스틱 셀 있음을 나타냅니다. 그러나 부상 뇌의 M / M 표현형 마커 표현, 자신의 colocalization을 시간적 진화의 전체 특성은 아직 행방 불명입니다.
구체적으로는 M / M 활성화의 관련 마커를 염색 면역 프로토콜은 허혈성 뇌에서 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 현지화와 같은 M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 촛점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시CD11b를, CD68, YM1, 중대 뇌동맥 (pMCAO)의 영구적 인 폐쇄에 의해 유도 된 국소 허혈의 마우스 모델에서. 오염 된 곳의 두 가지 차원의 분석은 각각의 마커가 정의 된 M / M의 형태에 관련된 및 허혈성 병변에 지정된 현지화를 가지고 있는지 알 수있다. M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴은 허혈 영역에서 입체 공 촛점 이미징에 의해 평가 될 수있다. 이미지가 비쳐 영향을 최소화하고, 파장 중복을 피하기 위해 순차 주사 모드 (180 X 135 X 10 ㎛의 부피에 해당하는 10 ㎛ Z 축 및 0.23 μm의 스텝 사이즈) 정의 된 볼륨에서 취득 할 수있다. 이미지이어서 Imaris 소프트웨어에 의해 입체 렌더링을 얻기 위해 처리된다. 세 가지 차원 렌더링의 단단한보기는 세포의 클러스터에있는 마커 식의 정의를 할 수 있습니다. 우리는 M / M은 병변 사이트 및 TI의 위치에 따라, 표현형의 다수쪽으로 분화하는 능력을 가지고 있음을 보여나 부상 후.
서론
급성 뇌 손상 후, 미세 아교 세포가 빠르게 활성화 극적인 형태 적 형질 1-3을 변경 받아야합니다. 이 내장 함수는 응답은 부상 뇌 실질 4.5으로 마이그레이션 혈액 태생의 대 식세포의 모집에 연결되어 있습니다. 항원 적으로 구별되지 않는 미세 아교 세포 및 대식 세포의 역할은 뇌 손상에서 여전히 논의된다 (이제부터 M / M라고한다). 연구의 증가는 유사 주변 식세포에 대해 설명한 것과, 미세 아교 세포와 뇌가 대식 세포는 그 극단 (M1) 고전적인 염증성 독성이나 항 염증 보호 (M2) 표현형에 해당하는 서로 다른 표현형을 가정 할 수 모집을 나타냅니다. 프로 또는 항 염증 인자의 분비를 포함하여 다른 활성 상태는, 신경 영양 분자와 리소좀의 활동 자료는 그 발현 시간에 따라 표현형 마커의 특정 패턴을 특징으로한다주변 환경의 진화. 손상된 뇌의 이러한 M / M의 표현형의 특성은 여전히 빈약하다. 우리는 뇌졸중 후 M / M 발현과 진화를 분석하는 pMCAo의 잘 확립 된 쥐 모델을 사용했다. 여기에 제시된 면역 형광 기반의 프로토콜은 특정 M / M 표현형 마커, 현지화 및 허혈성 지역에서 휴대 공동 식의 모양에 대한 통찰력을 얻기를 목표로하고 있습니다. 우리는 다른 활성화 상태 또는 표현형에 관련된 몇 가지 분자를 조사, 즉 CD11b를,....
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프로토콜
1. 면역 형광
다음의 프로토콜은 (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 식힌 50ml의 뒤에 PBS 20 ㎖, 0.1 몰 / 리터, pH가 7.4,) transcardially 관류 된 마우스로부터 얻은 뇌 관상 저온부에서 수행된다. 살포 후, 두뇌는 신중하게 제거하고 cryoprotection위한 4 ° C에서 하룻밤 PBS의 30 % 자당에 전송. 유리 병에 밀봉하여 -70 ° C에서 사용할 때까지에 저장되기 전에 3 분 동안 45 ° C - 뇌는 다음 빠르게에서 이소 펜탄에 담가 냉동. 코로나 뇌 저온부 (20 μm의)는 직렬로 잘라 면역 프로토콜 11, 6을 실시한다.
사용하기 전에 실온에 모든 시약 및 샘플을 가져와. 항체 혈청의 제시 작업 희석이 최적의 성능을 얻기 위해 만든 시험의 결과주의하시기 바랍니다. 다른 항체 및 혈청을 사용하는 경우, 프로토콜은 검증 될 필요가있다.
안티는 CD11b 및 안티 CD68 모두 차 항체는 쥐에서 만들어지기 때문에, 우리는 형광 신호 증폭과 함께 다음에 안티는 CD11b의 높은 희석을 사용 안티 쥐 알렉사 546에 의해 교차 신호를 방지 할 수 있습니다 TSA 키트 (Cy5....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
라벨 프로토콜 및 공 촛점 인수는 허혈 영역으로 수행 될 때 얻어진 결과의 일례는도 1a 및도 1b에 도시되어있다. 획득 된 영상의 2 차원보기는 허혈 후 이십사시간에서 (A), 리소좀 마커 CD68 (녹색) 허혈성 핵심에 존재 비대 ameboid CD11b를 세포 (적색)로 표시되어 있음을 보여줍니다. 국경 지역에서 (B)는 CD11b 양성 세포는 둥근 세포 기관 및 CD68에 대한 긍정적 인 분지의 프로세스를 표시합니다. Z 축 돌기 (오른쪽 아래 부분과 B)는 하나의 평면도에 설명 된 마커 분포는 또한 Z-축을 따라 존재하는지 여부를 시각화 할 수 있습니다. colocalization을가 발생할 경우, 노란색 픽셀이 생성됩니다. CD11b를는 C3 단편에 대한 수용체이며, 막 분포를 나타낸다. CD68는 리소좀 레이블 주로 세포질에 따라서 존재한다. CD11b/CD68 이중 양성 세포는 일반적 colo.......
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토론
우리는 여기에서 허혈 영역 (더 자세한 분석을 위해 심판 6 참조)에 M / M 표현형 마커의 현지화 및 공동 발현을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 초점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 세 가지 차원 공 촛점 이미징 M / M 활성화의 관련 마커의 특정 염색을 결합한다. 항체, 혈청 희석 작업을 fluorconjugated의 미세 조정은 조사 마커 잡음 비율로 최적의 신호를 할 수 있습니다. 입체 렌더링을 얻기 위해 이미지 처리는 M / M의 기능 상태의 획득 된 영상을 나타내는하고, 세포의 클러스터에 마커 표현의 정의를 허용 연구의 증가는 이제 M / M은 다양한 표현형을 획득하고 주변 신호에 따라 서로 다른 기능을 프로그램에 참여할 수있는 고도의 플라스틱 세포 것을 동의합니다. 염증 환경은 시간이 지남에 따라 진화하고 조율 할 수 있습니다M / M의 편광, 생체 내 연구에 훨씬 더 유익 체외 모델보다, 모집 / 활성화 된.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
스테파노 Fumagalli는 Monzino 재단의 동료입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | 친절하게 제공: Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| H– chst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat 항체 | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| 안티 마우스 Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| 안티 토끼 Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 컨포칼 현미경 | Olympus | ||
| AnalySIS 소프트웨어 | Olympus | ||
| Bitplane | |||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| 소프트웨어 패키지 GraphPad Prism 버전 4.0 | GraphPad 소프트웨어 Inc. |
참고문헌
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. Microglial activation in stroke: therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7, 37....
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재인쇄 및 허가
