Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

Summary

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Abstract

Na hersenenslag microglia / macrofagen (M / M) ondergaan snelle activering met dramatische morfologische en fenotypische veranderingen die expressie van het nieuwe oppervlakte-antigenen en productie van mediatoren die de opbouw en de ontstekingsreactie te handhaven omvatten. Opkomende bewijs geeft aan dat M / M zijn zeer plastic cellen die klassieke pro-inflammatoire (M1) of een andere anti-inflammatoire (M2) activering na een acuut hersenletsel kan aannemen. Maar een volledige karakterisering van M / M fenotype markerexpressie, hun colocalization en temporele evolutie in de beschadigde brein is nog steeds vermist.

Immunofluorescentie specifiek beoordeelt kleuring relevante markers van M / M activering kan worden uitgevoerd in de ischemische hersenen. Hier presenteren we immunofluorescentie gebaseerde protocollen gevolgd door drie-dimensionale confocale analyse als een krachtige aanpak om het patroon van lokalisatie en co-expressie van M / M fenotype merkers zoals onderzoekenCD11b, CD68, Ym1, in muismodel ischemie geïnduceerd door permanente occlusie van de middelste cerebrale slagader (pMCAO). Tweedimensionale analyse van de vlek zien dat elke merker is gekoppeld aan een bepaalde M / M morfologie en een gegeven locatie in het ischemische letsel. Patronen van M / M fenotype marker co-expressie kan worden beoordeeld door driedimensionale confocale beeldvorming in het ischemische gebied. Afbeeldingen kunnen worden verkregen over een bepaald volume (10 urn z-as en een 0,23 urn stapgrootte, corresponderend met een 180 x 135 x 10 micrometer volume) met een sequentiële scan modus doorbloeding te minimaliseren en golflengte overlapping te vermijden. De beelden worden dan verwerkt tot driedimensionale renderings verkrijgen volgens Imaris software. Solid van drie dimensionale renderings maakt de definitie van markerexpressie in clusters van cellen. We zien dat M / M hebben de mogelijkheid om te differentiëren naar een veelheid van fenotypes, afhankelijk van de locatie van de laesie en time na een blessure.

Introduction

Na een acuut hersenletsel, worden microglia snel geactiveerd en ondergaan dramatische morfologische en fenotypische veranderingen ^1-3. Deze intrinsieke reactie wordt geassocieerd met de aanwerving van bloed geboren macrofagen, die migreren naar de verwonde hersenen parenchym ^4,5. De rol van microglia en macrofagen die antigeen zijn niet te onderscheiden (hierna te noemen M / M) in hersenletsel is nog steeds gedebatteerd. Een toenemend aantal studies blijkt dat, overeenkomstig hetgeen beschreven perifere macrofagen en microglia hersenen geworven macrofagen kunnen verschillende fenotypes die extremen overeen met klassieke pro-inflammatoire toxisch (M1) of anti-inflammatoire beschermende (M2) fenotype aannemen. De verschillende activatie staten, waaronder uitscheiding van pro-of anti-inflammatoire factoren, neurotrofe afgifte van moleculen en lysosomale activiteit worden gekenmerkt door een specifiek patroon van fenotypische merkers, waarvan de expressie afhankelijk is van de temporeleontwikkeling van de omgeving. De karakterisatie van deze M / M fenotypes in de verwonde hersenen is nog steeds schaars. We gebruikten een gevestigde muizenmodel van pMCAo naar M / M expressie en evolutie na een beroerte te analyseren. Immunofluorescentie gebaseerde protocollen hier gepresenteerd gericht op het verkrijgen van inzicht in het optreden van de specifieke M / M fenotype markers, hun lokalisatie en cellulaire co-expressie in het ischemische gebied. We onderzochten een paar moleculen gekoppeld aan verschillende activering staat of fenotype, namelijk CD11b, een oppervlakte marker door leukocyten en een veel gebruikte marker van M / M activering / recruitment ^6-8 uitgedrukt, CD68 een marker van lysosomen ^6,7 en Ym1 een secretoire eiwit door alternatief geactiveerde (M2) macrofagen tot expressie gebracht en gekoppeld aan herstel en functieherstel ^9-10.

Wanneer twee markers worden uitgedrukt door dezelfde cel, maar in verschillende subcellulaire compartimenten kan colocalization alleen veel inf nietormative. In dit geval kan de analyse van co-expressie worden uitgevoerd door een enkele bovenaanzicht en driedimensionale weergaven. We hier een protocol beschrijven aan een grondige driedimensionale analyse van de marker co-expressie te verkrijgen.

Protocol

1. Immunofluorescentie Het volgende protocol wordt uitgevoerd op vriescoupes coronale hersenen verkregen transcardiale perfusie muizen (20 ml PBS, 0,1 mol / l, pH 7,4, gevolgd door 50 ml koud 4% paraformaldehyde in PBS). Na perfusie worden hersenen zorgvuldig verwijderd en overgebracht naar 30% sucrose in PBS bij 4 ° C overnacht voor cryobescherming. De hersenen worden vervolgens snel bevroren door onderdompeling in isopentaan bij – 45 ° C gedurende 3 min voordat ze verzegeld in flesjes en o…

Representative Results

An example of the results obtained when labeling protocols and confocal acquisitions are carried out into the ischemic region is illustrated in Figures 1A and 1B. A two dimensional view of acquired images shows that at twenty-four hours after ischemia (A), the lysosomal marker CD68 (green) is expressed in hypertrophic ameboid CD11b cells (red) present in the ischemic core. In the border zone (B) CD11b positive cells display round cell bodies and ramified…

Discussion

We present here immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate localization and co-expression of M/M phenotype markers into the ischemic area (for a more detailed analysis see ref ⁶). This method combines specific staining of relevant marker of M/M activation with three-dimensional confocal imaging. The fine tuning of antibodies, serum and fluorconjugated working dilutions allows optimal signal to noise ratio of the investigated m…

Materials

			Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
Hoechst 33342	Life technologies	H21492
Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinilated Goat Anti-Rat antibody	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-rabbit Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normal Goat Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Phosphate Buffered Saline	Sigma	P4417-100
			Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscope	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Software packages GraphPad Prism version 4.0	GraphPad Software Inc.