Un régulée par la tetracycline lignée cellulaire produit vecteurs lentiviraux titre élevé qui ciblent spécifiquement les cellules dendritiques
Summary
Ici, nous utilisons transduction rétrovirale et transfection concatémérique pour créer une lignée cellulaire qui peut exprimer les composantes d'un vecteur lentivirus (LV) en l'absence de tétracycline. Ce LV code pour la GFP et est pseudotypé avec une glycoprotéine, SVGmu, qui est spécifique d'un récepteur sur les cellules dendritiques.
Abstract
Les vecteurs lentiviraux (LV) sont un puissant moyen de fournir du matériel génétique à de nombreux types de cellules. En raison de problèmes de sécurité liés à ces VIH-1 vecteurs dérivés, produisant de grandes quantités de volumes logiques est difficile. Dans cet article, nous présentons une méthode pour produire des titres élevés d'VL auto-inactivant. Nous transduire rétrovirale le tet-off stable producteur lignée cellulaire GPR pour produire une lignée cellulaire, GPRS, qui peut exprimer tous les composants viraux, dont une glycoprotéine spécifique de la cellule dendritique, SVGmu. Ensuite, nous utilisons la transfection d'ADN concatémérique pour transfecter le transfert plasmide codant pour la GFP LV un gène rapporteur en combinaison avec un marqueur sélectionnable. Plusieurs des clones obtenus peuvent produire LV à un titre de 10 fois supérieure à ce que nous réalisons avec transfection transitoire. De plus, ces virus transduire efficacement des cellules dendritiques in vitro et génèrent une forte réponse immunitaire cellulaire de T à notre antigène de journaliste. Cette méthode peut être une bonne option for la production de vaccins à base de fortes LV pour les études cliniques de cancer ou de maladies infectieuses.
Introduction
Beaucoup de systèmes de vecteurs ont été développés pour la livraison de gènes. Vecteurs basés sur les lentivirus ont été parmi système virale la plus couramment étudiée. Ces vecteurs sont avantageux car ils peuvent transduire efficacement à la fois la division et non les cellules en division 1, obtenir une expression à long terme en raison de l'intégration dans le génome de l'hôte, présentent une faible immunité anti-vecteur naturel dans la plupart des populations humaines 2, et ont un faible potentiel de génotoxicité de mutagenèse par insertion 3,4.
La production de lentivirus a toujours été colorée par des préoccupations de sécurité. Les vecteurs lentiviraux sont généralement dérivés du VIH-1, l'agent étiologique du sida. Transfection transitoire de composants individuels du lentivector (transfert, l'enveloppe, et des plasmides d'emballage) est un moyen commun et flexible de livrer du matériel génétique en laboratoire. Cependant, l'extension des transfections transitoires pour des applications cliniques est lourd et may conduire à l'élaboration de lentivirus compétent pour la réplication 5,6. Pour surmonter ces obstacles, plusieurs emballage stable et lignées cellulaires de production ont été développées 6-11. Une de ces lignes, la ligne de conditionnement GPR 11, présente l'avantage d'être attrayant régulée par la tétracycline. Dans cet article, nous montrons comment adapter ce système à produire des auto-inactivant les vecteurs lentiviraux qui sont spécifiquement ciblés vers les cellules dendritiques (DC-LV) 12.
Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigène les plus solides du système immunitaire. Ils ont fait l'objet d'un grand intérêt dans le développement du vaccin contre le cancer parce qu'ils initient directement, programme et régulent les réponses immunitaires spécifiques de la tumeur 13. Intégrant un protocole de vaccination afin d'inclure les PED a le potentiel de déclencher une réponse immunitaire antitumorale plus forte que peptidiques ou vaccins ADN. Récemment, nous avons développé un vecteur lentivirus qui specifically cible les cellules dendritiques par une glycoprotéine du virus de la sindbis modifiée, SVGmu 14. Ces vecteurs sont uniques en ce qu'ils montrent une grande spécificité pour les cellules dendritiques et générer des réponses immunitaires plus fortes que non spécifiques, vecteurs VSVg-pseudotypées.
Ici, nous présentons une méthode pour produire de grandes quantités de ces vecteurs lentiviraux DC ciblées. Nous démontrons que ces DC-LV peut infecter les PED et générer de fortes réponses immunitaires T CD8 + de cellules T. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées avec humanité, sous l'approbation de l'USC Intitutional protection des animaux et le Comité d'utilisation. Afin de réaliser des expériences in vivo et clinique, il est essentiel de créer une lignée cellulaire qui peut produire des virus à un titre élevé. Effectuer les étapes de transduction et transfection exactement comme décrit permettra de maximiser les chances de générer un tel clone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode pour produire de grandes quantités de vecteurs lentiviraux utilisant des cellules 293T stable transduites avec tous les composants lentiviraux sous la tet off système de réglementation. À ce jour, la plupart des protocoles pour produire des vecteurs lentiviraux reposent sur la transfection transitoire de phosphate de calcium standard (voir 18, par exemple). Cette approche a été couronnée de succès sur une échelle clinique, mais elle peut souffrir de certaine…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Michael Chou, Bingbing Dai, et Liang Xiao pour contribuer données pour ce manuscrit. Nous remercions également le Dr John Gray pour les dons généreux des réactifs utilisés dans cette étude. PB est soutenue par une bourse de recherche postdoctorale du Centre national du cancer. Cette recherche a été financée par des subventions de l'Institut national de la santé (R01AI68978, P01CA132681 et RCA170820A), une subvention de la Fondation Bill et Melinda Gates, une subvention d'accélération de translation de la Joint Center for Translational Medicine et une subvention de la Californie du VIH / SIDA Programme de recherche.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
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