سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد
Summary
ويمكن إدراج حيويا درجة الحموضة استجابة nanosensors سول جل في بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) السقالات electrospun. السقالات الإبلاغ الذاتي المنتجة يمكن استخدامها لرصد الوضع الطبيعي من الظروف microenvironmental في حين زرع الخلايا على السقالة. هذا هو مفيد مثل بناء الخلوية 3D يمكن رصدها في الوقت الحقيقي من دون إزعاج التجربة.
Abstract
ويعتقد أن زراعة الخلايا في 3D على السقالات المناسبة لتقليد بشكل أفضل في الجسم الحي المكروية وزيادة التفاعلات خلية خلية. يمكن أن ينجم عنها من بناء الخلوية 3D غالبا ما تكون أكثر ملاءمة لدراسة الأحداث والتفاعلات الجزيئية خلية خلية من التجارب المماثلة درس في 2D. لخلق 3D الثقافات الفعال مع بقاء الخلية عالية في جميع أنحاء سقالة الشروط الثقافة مثل الأكسجين ودرجة الحموضة ضرورة أن يكون للرقابة بعناية كما التدرجات في تركيز تحليلها يمكن أن توجد في جميع أنحاء بناء 3D. نحن هنا وصف الطرق إعداد حيويا درجة الحموضة استجابة nanosensors سول جل وإدماجها في بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) السقالات electrospun جنبا إلى جنب مع إعدادها لاحقة للثقافة خلايا الثدييات. السقالات استجابة درجة الحموضة يمكن استخدامها كأدوات لتحديد درجة الحموضة microenvironmental ضمن بناء الخلوية 3D. وعلاوة على ذلك، ونحن من التفصيل تسليم الحموضة nanose استجابةnsors على البيئة داخل الخلايا من خلايا الثدييات الذي كان مدعوما من السقالات electrospun PLGA النمو. موقع حشوية من nanosensors استجابة درجة الحموضة يمكن أن تستخدم لرصد درجة الحموضة داخل الخلايا (PHI) خلال التجريب المستمر.
Introduction
استراتيجية رئيسية في هندسة الأنسجة هو استخدام مواد حيويا لافتعال السقالات التي تشبه الأنسجة التي أريد لها أن تحل محل وقادر أيضا على دعم نمو الخلايا وظيفة 1،2 التشكل. يوفر السقالة الدعم الميكانيكية من خلال السماح مرفق الخلية والانتشار حتى الآن يسمح الهجرة الخلية في جميع أنحاء الفجوات لبناء الخلوية 3D. يجب السقالة تسمح أيضا لنقل كميات كبيرة من المواد الغذائية وخلية لا تمنع إزالة النفايات الأيضية 3.
وقد برزت Electrospinning كوسيلة من وسائل واعدة لتصنيع السقالات البوليمرية قادرة على دعم النمو الخلوي 4-6. الألياف electrospun محبوكة المنتجة هي مناسبة لنمو الخلايا كما أنها غالبا ما تكون مسامية تسمح والتفاعل خلية خلية، وكذلك الهجرة الخلية في جميع أنحاء الفجوات لبناء الخلوية 3D 7. فمن المهم رصد بقاء الخلية أثناء رانه الفترة من الثقافة وضمان بقاء الخلية يتم الاحتفاظ في كل أنحاء لبناء 3D. على سبيل المثال، وظروف ثقافة مثل الأكسجين ودرجة الحموضة تتطلب التحكم الدقيق، وتدرجات في تركيز تحليلها يمكن أن توجد داخل بناء 3D. المفاعلات الحيوية أو نظم الارواء يمكن استخدامها لتقليد في ظروف المجراة من تدفق الخلالي ونتيجة لنقل المواد الغذائية نتيجة زيادة وإزالة النفايات الأيضية 8. مسألة ما إذا كانت مثل هذه الأنظمة وضمان ظروف microenvironmental ثابتة يمكن معالجتها من خلال تقييم المكروية الخلوية في الوقت الحقيقي.
مقاييس المكروية الأساسية التي يمكن رصدها في الوقت الحقيقي وتشمل: درجة الحرارة، والتركيب الكيميائي للخلية وسائل الإعلام، وتركيز الأكسجين المذاب وثاني أكسيد الكربون، ودرجة الحموضة، والرطوبة. من هذه المقاييس، ودرجة الحرارة يمكن رصدها بسهولة أكثر باستخدام تحقيقات في الموقع. أساليب لرصد المقاييس المدرجة المتبقية عادة فيإزالة فوالذي من قسامة لأخذ العينات وبالتالي تعكير صفو زراعة الخلايا وتزيد من خطر التلوث. يجري البحث المستمر، وأساليب الوقت الحقيقي. عادة ما تعتمد أساليب الرصد الحالي على الصكوك التي بحث جسديا بناء الخلوية مثل جهاز الحموضة أو التحقيق الأوكسجين. ومع ذلك، يمكن لهذه الأساليب تطفلا تلف بناء الخلوية وتعكر صفو التجربة الجارية. رصد موسع تركيزات تحليلها ضمن بناء 3D يمكن تمكين مراقبة الوقت الحقيقي من الجوانب البيئية المختلفة مثل نضوب المغذيات 9. هذا من شأنه أن تسمح بتقييم توريد المواد الغذائية إلى مناطق أعمق داخل الهيكل وتحديد ما إذا كان يجري إزالة النفايات الأيضية بشكل فعال 10،11. الأنظمة التي تحاول معالجة مسألة الغزو تنطوي عموما على استخدام غرفة نضح الذي يمر مستنبت من خلال كل سفينة الثقافة وأجهزة الاستشعار الخارجية لرصد درجة الحموضة والأوكسجين والجلوكوز 12. الإعادة اهتماما متزايدا في تطوير أجهزة الاستشعار التي يمكن دمجها مباشرة في سفينة الثقافة التي لا تتطلب إزالة قسامة لأخذ العينات وعلى هذا النحو من شأنه أن يوفر الرصد في الموقع.
لمعالجة هذه النواقص لفي الموقع ورصد موسع الظروف microenvironmental أدخلنا الحليلة nanosensors استجابة إلى السقالات electrospun لإنتاج السقالات الإبلاغ الذاتي 13. تم إعداد السقالات التي تعمل أجهزة الاستشعار عن بعد من خلال رصد النشاط مضان من قبل، حيث كان الجهاز الاستشعار إما السقالة البوليمرية الفعلية التي أنشأتها electrospinning أو من خلال استخدام صبغ استجابة تحليلها والتي يتم تضمينها في البوليمر قبل تشكيل سقالة 14،15 . ومع ذلك، وهذه الأجهزة الاستشعار لديها القدرة على إعطاء المخرجات البصرية الخاطئة الناجمة عن تدخل محتمل من التحاليل الأخرى. استخدام جهاز الاستشعار ratiometric سوالفصل عن تلك التي أعدت في البروتوكول وصفها تحمل في طياتها احتمال للقضاء على هذه الآثار السلبية المحتملة وتوفير استجابة محددة لتحليلها في السؤال.
تم إعداد السقالات electrospun المقدمة هنا من الاصطناعية شارك في البوليمر بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA)، يتم اختيارهم بسبب وجود إدارة الغذاء والدواء (FDA) الموافقة، نظرا لخواصه القابلة للتحلل حيويا ومسار و سجل لدعم النمو والوظائف من مختلف أنواع الخلايا 16-18. الحليلة ratiometric nanosensors استجابة استعداد تستجيب لدرجة الحموضة. وnanosensors دمج اثنين من الأصباغ الفلورية في حيويا مصفوفة جل سول حيث الصبغة واحد، FAM تستجيب لدرجة الحموضة وغيرها، TAMRA بمثابة معيار الداخلية كما أنها ليست استجابة لدرجة الحموضة. علاوة على ذلك، مضان من كل من FAM وTAMRA يمكن تحليلها بشكل منفصل لأنها لا تتداخل بشكل كبير. تحديد نسبة EMI مضانssion كل من الأصباغ في موجات محددة يعطي استجابة درجة الحموضة مستقلة عن الظروف البيئية الأخرى. السقالات الإبلاغ الذاتي يمكن أن تسمح تقييم تكرار درجة الحموضة في الموقع وفي الوقت الحقيقي دون تعطيل نموذج 3D المتقدمة. لقد أثبتنا أن هذه السقالات هي قادرة على دعم مرفق الخلية والانتشار وتبقى استجابة لتحليلها في السؤال. حركية الحمضية من المنتجات في بنيات هندسيا يبقى سلوكه وعلى هذا النحو باستخدام السقالات استجابة درجة الحموضة يمكن أن يسهل إلى حد كبير مثل هذه الدراسات 19. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام السقالات الإبلاغ الذاتي لتطبيقات هندسة الأنسجة ويقدم الفرصة لنفهم تماما، ورصد وتحسين نمو 3D نموذج يبني الأنسجة في المختبر، وnoninvasively في الوقت الحقيقي.
كما تم تسليم nanosensors استجابة درجة الحموضة للبيئة داخل الخلايا الليفية مثقف على electrospun PLGA scaffolس. واستخدمت نسبة الانبعاثات مضان من الأصباغ لمراقبة PHI ومقارنة الإبلاغ الذاتي سقالة إدراج عنصر nanosensors درجة الحموضة. تسليم nanosensors إلى الخلايا المستزرعة في بيئة 3D قد تمكن من رصد تركيز الحليلة عميقة داخل بناء بطريقة غير تدميري. لذا nanosensors قد يكون أداة ناجعة التصوير لتقييم سلوك الخلية غير بشكل هدام في جميع أنحاء 3D يبني يسمح التحليل على المدى الطويل. يمكن فحص تركيز الحليلة من الخلايا الفردية داخل بناء 3D ضمان أنهم يتلقون تركيزات المغذيات والأكسجين الكافي. المعلمات عملية الرصد يمكن أن تساعد في تطوير تقنيات موحدة للنقل الجماعي الفعال من الأوكسجين والمواد المغذية. يمكن الجمع بين تقديم nanosensors على البيئة داخل الخلايا وإدماج nanosensors في السقالات البوليمرية للسماح بتقييم بقاء الخلية فضلا عن الأداء داخل سقالة 3D كانت constructs أثناء عملية نمو الأنسجة. هذا قد يؤدي إلى زيادة المعرفة من هذه التركيبات وتقدم في تصنيع بدائل الأنسجة ذات الصلة من الناحية البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هندسة الأنسجة يطمح لخلق بدائل البيولوجية التي يمكن استخدامها على حد سواء كما في الجسم الحي في المختبر مثل نماذج الأنسجة والعلاج في استبدال الأنسجة لإصلاح، استبدال، والحفاظ على أو تعزيز وظيفة الأنسجة أو عضو معين. وقد استخدمت البدائل الاصطناعية لسنوات عديدة لاس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المسلم به بتمويل من BBSRC التفضل (عدد المنح BB H011293 / 1).
Materials
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?. Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 – 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
