Selvrapportering Stilladser for 3-Dimensional Cell Culture
Summary
Biokompatible pH responsive sol-gel nanosensorer kan inkorporeres i poly (mælke-co-glycolsyre) (PLGA) Electrospun stillads. De producerede selvrapportering stilladser kan bruges til in situ overvågning af microenvironmental, men samtidig dyrkning af celler på stilladset. Dette er en fordel, da 3D cellulære konstruktion kan overvåges i realtid uden at forstyrre eksperimentet.
Abstract
Dyrkning af celler i 3D på passende stilladser menes at bedre efterligne in vivo mikromiljø og øge celle-celle interaktioner. Den resulterende 3D cellulære konstruktion kan ofte være mere relevant at studere de molekylære begivenheder og celle-celle interaktioner end lignende forsøg studeret i 2D. At skabe effektiv 3D-kulturer med levedygtighed høj celle i hele stilladset dyrkningsbetingelserne såsom ilt og pH skal nøje kontrolleres som gradienter i analytkoncentration kan findes i hele 3D-konstruktion. Her beskriver vi metoder til at forberede biokompatible pH responsive sol-gel nanosensorer og deres inkorporering i poly (mælkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) Electrospun stilladser sammen med deres efterfølgende forberedelse til dyrkning af pattedyrceller. PH-reagerende stilladser kan anvendes som værktøjer til at bestemme microenvironmental pH inden en 3D cellulær konstruktion. Desuden er vi detalje leveringen af pH lydhør nanosensors til det intracellulære miljø af mammale celler, hvis vækst blev understøttet af Electrospun PLGA stillads. Det cytoplasmatiske placering af pH-reagerende nanosensorer kan anvendes til at overvåge intracellulære pH (pHi) under igangværende eksperimenter.
Introduction
En vigtig strategi i vævsteknik er brugen af biokompatible materialer til at fabrikere stilladser, hvis morfologi ligner det væv, at det kommer til at erstatte og er også i stand til at understøtte cellevækst og funktion 1,2. Stilladset giver mekanisk støtte ved at tillade cellebinding og proliferation tillader alligevel cellemigrering gennem mellemrummene i en 3D cellulær konstruktion. Stilladset skal også give mulighed for transport af celle næringsstoffer masse og ikke hæmme fjernelsen af metaboliske affald 3.
Electrospinning er dukket op som en lovende metode til fremstilling af polymere stilladser stand til at understøtte cellevækst 4-6. De ikke-vævede Electrospun fremstillede fibre er egnede til cellevækst, som de ofte er porøse og tillader celle-celle-interaktion samt cellemigrering gennem mellemrummene i en 3D cellulær konstruktion 7. Det er vigtigt at overvåge cellelevedygtighed under tHan periode af kultur og sikre, at cellernes levedygtighed opretholdes i hele 3D-konstruktion. For eksempel dyrkningsbetingelser, såsom oxygen og pH kræver omhyggelig kontrol som gradienter i analytkoncentrationen kan eksistere i 3D-konstruktionen. Bioreaktorer eller perfusion systemer kan anvendes til at efterligne in vivo betingelser interstitiel flow og en overførsel resultat forøgelse af næringsstoffer og fjernelse 8 metaboliske affald. Spørgsmålet om, hvorvidt sådanne systemer sikrer konstante microenvironmental forhold kan løses ved at vurdere den cellulære mikromiljø i real-tid.
Vigtige microenvironment målinger, der kan overvåges i realtid omfatter: temperatur, kemisk sammensætning af celle medier, koncentration af opløst ilt og kuldioxid, pH og fugtighed. Af disse målinger kan temperaturen lettest overvåges ved hjælp af in situ-prober. Metoder til overvågning af de resterende børsnoterede målinger almindeligt ivolve fjernelse af en portion til prøveudtagning og dermed forstyrre den celle kultur og øge risikoen forurening. Kontinuerlig, real-time metoder er der søges. Nuværende overvågningsmetoder normalt stole på instrumenter, der fysisk probe cellulær konstruktion såsom en pH-monitor eller ilt sonde. Dog kan disse indgribende metoder beskadige cellulære konstruktion og forstyrre den igangværende eksperiment. Noninvasiv monitorering af analytkoncentrationer inden for 3D-konstruktion kunne gøre det muligt real-time overvågning af forskellige miljømæssige aspekter såsom næringsstof udtynding 9. Dette ville muliggøre vurdering af næringsstofforsyning til dybere regioner i struktur og afgøre, om metaboliske affald blev fjernet effektivt 10,11. Systemer, der forsøger at løse problemet er invasiv involverer generelt brug af et perfusionskammer der passerer dyrkningsmedium gennem både kultur fartøj og til eksterne sensorer til overvågning af pH, ilt og glukose 12. Denre er voksende interesse i at udvikle sensorer, der kan integreres direkte i dyrkningsbeholderen, som ikke kræver fjernelse af en portion til prøveudtagning, og som sådan ville give in situ overvågning.
For at imødegå sådanne mangler til in situ og ikke-invasiv monitorering af microenvironmental betingelser, vi har indarbejdet analyt responsive nanosensorer i Electrospun stilladser til at producere selvrapportering stilladser 13. Stilladser, der fungerer som detekteringsanordninger ved at overvåge fluorescens aktivitet, er blevet fremstillet tidligere, hvor affølingsanordningen var enten den faktiske polymere stillads lavet af electrospinning eller ved anvendelse af en analyt reagerende farvestof, som er inkorporeret i polymeren forud for stillads dannelse 14,15 . Men disse følere har potentiale til at give fejlagtige optiske udgange forårsaget af mulig interferens fra andre analytter. Anvendelsen af en ratiometrisk detekteringsanordning such som dem, der fremstilles i den beskrevne protokol har potentiale til at eliminere disse mulige bivirkninger og give en reaktion specifik for analysanden pågældende.
De Electrospun stilladser præsenteres her, er blevet fremstillet af den syntetiske co-polymer poly (mælkesyre-co-glykolsyre) (PLGA), som er udvalgt på grund at have Food and Drug Administration (FDA) godkendelse på grund af dets biologisk nedbrydelige og biokompatible egenskaber, og et spor referat af støtte væksten og funktionen af forskellige celletyper 16-18. De forberedte ratiometrisk analyt responsive nanosensorer er lydhøre over for pH. Nanosensorerne optage to fluorescerende farvestoffer i en biokompatibel sol-gel-matrix, hvor et farvestof, FAM reagerer på pH og den anden TAMRA fungerer som en intern standard, da det ikke reagerer på pH. Endvidere fluorescensen af både FAM og TAMRA kan analyseres separat som de ikke i væsentlig grad overlapper. At bestemme forholdet mellem fluorescens emission begge farvestoffer ved specifikke bølgelængder giver en pH-reaktion uafhængig af andre miljøforhold. De selvrapportering stilladser kan tillade gentagelse vurdering af pH in situ og i real-tid uden at forstyrre den udviklede 3D-model. Vi har vist, at disse stilladser er i stand til at understøtte cellefastgørelse og spredning og forblive lydhør over for analysanden pågældende. Kinetikken af sure biprodukter i manipuleret konstruktioner forbliver understudied og som sådan ved hjælp af pH-reagerende stilladser kan i høj grad lette sådanne undersøgelser 19. Desuden er brugen af selvrapportering stilladser til vævsdyrkningsapplikationer præsenterer mulighed for fuldt ud at forstå, overvåge og optimere væksten af 3D-modellen vævskonstruktioner in vitro, noninvasively og i real-tid.
De pH responsive nanosensorer er også blevet leveret til det intracellulære miljø af fibroblaster dyrket på electrospun PLGA stilladsetds. Forholdet mellem fluorescensemission fra farvestofferne blev anvendt til at overvåge pHi og sammenlignet med en selvstændig rapportering stillads Omfattende pH nanosensorer. Leveringen af nanosensorer til celler dyrket i et 3D-miljø kunne muliggøre overvågning af analytkoncentrationen dybt i konstruktionen på en destruktiv måde. Derfor nanosensorer kan være en levedygtig billedbehandling værktøj for ikke-destruktivt vurdere celle adfærd i 3D konstruktioner tillader langsigtet analyse. Screening analysandkoncentrationen af de enkelte celler inden for en 3D-konstruktion kunne sikre, at de modtager tilstrækkelige koncentrationer af næringsstoffer og ilt. Overvågning procesparametre kunne bidrage til udviklingen af standardiserede teknikker til effektiv masse transport af ilt og næringsstoffer. Leveringen af nanosensorer til det intracellulære miljø og inkorporering af nanosensorer til polymere stilladser kunne kombineres for at muliggøre vurdering af celleviabilitet samt stillads resultater inden 3D constructs under vævsvækst processen. Dette kan føre til øget viden om disse konstruktioner og fremskridt i fremstilling af biologisk relevante væv erstatninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vævsmanipulering aspirerer til at skabe biologiske erstatninger, der kan bruges både som in vivo som in vitro vævsmodeller og i væv substitutionsterapi til at reparere, udskifte, vedligeholde eller forbedre funktionen af et bestemt væv eller organ. Syntetiske erstatninger har været brugt i mange år til at erstatte eller hjælp reparation af væv, men disse ofte mislykkes på grund af dårlig integration med værten væv og / eller infektion, som i sidste ende fører til afvisning eller yderliger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering fra BBSRC er venligst anerkendt (tilskud nummer BB H011293 / 1).
Materials
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?. Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 – 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
