Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire
Summary
PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d'auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l'échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturber l'expérience.
Abstract
La culture de cellules en 3D sur des échafaudages appropriés est pensé pour mieux imiter le microenvironnement in vivo et augmenter les interactions cellule-cellule. La construction cellulaire 3D obtenu peut souvent être plus pertinent d'étudier les événements moléculaires et interactions cellule-cellule que des expériences similaires étudiés en 2D. Pour créer des cultures 3D efficaces avec la viabilité cellulaire élevée tout au long de l'échafaud les conditions de culture tels que l'oxygène et le pH ont besoin d'être soigneusement contrôlé que les gradients de concentration de l'analyte peuvent exister tout au long de la construction 3D. Nous décrivons ici des procédés de préparation de pH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel et leur incorporation dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées ainsi que leur préparation ultérieure pour la culture de cellules de mammifères. Les échafaudages pH sensibles peuvent être utilisés comme outils pour déterminer microenvironnement pH dans une construction cellulaire 3D. En outre, nous détaillons la livraison de pH nanose sensiblensors à l'environnement intracellulaire de cellules de mammifères dont la croissance a été soutenue par des échafaudages PLGA électrofilé. La localisation cytoplasmique des pH nanocapteurs sensibles peut être utilisé pour contrôler le pH intracellulaire (pHi) lors de l'expérimentation en cours.
Introduction
Une stratégie clé dans l'ingénierie tissulaire est l'utilisation de matériaux biocompatibles pour fabriquer des échafaudages dont la morphologie ressemble le tissu qu'il va remplacer et est également capable de soutenir la croissance et la fonction 1,2 cellule. La matrice de support fournit un support mécanique en permettant la fixation des cellules et la prolifération permet encore de la migration des cellules à travers les interstices d'une construction cellulaire 3D. L'échafaudage doit également permettre le transport de masse de nutriments cellulaires et pas inhiber l'enlèvement des déchets métaboliques 3.
Électrofilage a émergé comme un procédé prometteur pour la fabrication d'échafaudages polymères capables de soutenir la croissance cellulaire de 4-6. Les fibres électrofilées non tissées produites sont appropriées pour la croissance cellulaire car elles sont souvent poreuses et permettent l'interaction cellule-cellule, ainsi que la migration des cellules à travers les interstices d'une construction 3D cellulaire 7. Il est important de surveiller la viabilité des cellules au cours de til période de culture et de faire en sorte que la viabilité cellulaire est maintenue tout au long de l'ensemble de la construction 3D. Par exemple, des conditions de culture, tels que l'oxygène et le pH nécessitent un contrôle soigneux, que les gradients de concentration de l'analyte peut exister dans le produit de construction 3D. Bioréacteurs ou des systèmes de perfusion peuvent être utilisés pour mimer les conditions in vivo de débit interstitiel et en tant que résultat de l'augmentation transfert des nutriments et l'élimination des déchets du métabolisme 8. La question de savoir si ces systèmes sont en s'assurant des conditions de micro constants peut être adressée en évaluant le microenvironnement cellulaire en temps réel.
Les principaux paramètres de micro-environnement qui pourraient être surveillés en temps réel comprennent: la température, la composition chimique du support de cellules, la concentration de l'oxygène dissous et le gaz carbonique, le pH et l'humidité. Parmi ces paramètres, la température peut être plus facilement contrôlée en utilisant des sondes in situ. Méthodes de suivi des mesures énumérées restants couramment dansenlèvement de volve d'une aliquote d'échantillonnage et donc perturbent la culture cellulaire et d'augmenter le risque de contamination. , Les méthodes en temps réel en continu sont recherchés. Méthodes actuelles de surveillance s'appuient généralement sur des instruments qui sondent physiquement la construction cellulaire comme un moniteur de pH ou de la sonde d'oxygène. Cependant, ces méthodes intrusives peuvent endommager la construction cellulaire et perturber l'expérience en cours. Surveillance non invasive des concentrations de l'analyte dans la construction 3D pourrait permettre un suivi en temps réel des différents aspects environnementaux tels que l'épuisement des nutriments 9. Cela permettrait une évaluation de l'apport de nutriments à l'intérieur des régions plus profondes de la structure et déterminer si les déchets métaboliques a été éliminé efficacement 10,11. Les systèmes qui tentent de répondre à la question de l'invasivité impliquent généralement l'utilisation d'une chambre de perfusion qui passe à travers un milieu de culture à la fois du récipient de culture et à des capteurs externes pour surveiller le pH, l'oxygène et le glucose, 12. Lare un intérêt croissant dans le développement de capteurs qui peuvent être directement intégrées dans le récipient de culture qui ne nécessitent pas l'élimination d'une partie aliquote de l'échantillonnage et en tant que tel serait d'assurer une surveillance in situ.
Pour remédier à ces lacunes pour in situ et de la surveillance non invasive des conditions micro-environnementales que nous avons incorporés analyte nanocapteurs sensibles dans les échafaudages électrofilées à produire des échafaudages d'auto-déclaration 13. Les échafaudages qui agissent dispositifs comme de détection par contrôle de l'activité de fluorescence ont été préparés préalablement, où le dispositif de détection est soit l'échafaudage polymérique réelle créée par électrofilage ou par l'utilisation d'un colorant sensible à l'analyte, qui est incorporé dans le polymère avant la formation de l'échafaudage 14,15 . Cependant, ces dispositifs de détection ont le potentiel d'améliorer les sorties optiques erronées causées par des interférences provenant d'autres analytes possible. L'utilisation d'un dispositif de détection ratiométrique such que ceux préparés dans le protocole décrit détient le potentiel d'éliminer ces effets indésirables possibles et apporter une réponse spécifique à l'analyte en question.
Les échafaudages électrofilées présentés ici ont été préparés à partir de poly co-polymère synthétique (acide lactique-co-glycolique) (PLGA), choisi en raison d'avoir Food and Drug Administration (FDA), en raison de ses propriétés biodégradables et biocompatibles et une piste enregistrement de soutenir la croissance et la fonction des divers types de cellules 16 à 18. Les analytes quotientométrique nanocapteurs sensibles préparés sont sensibles au pH. Les nanocapteurs incorporent deux colorants fluorescents dans une matrice sol-gel biocompatible, où un colorant, FAM est sensible au pH et l'autre, TAMRA agit comme étalon interne car il n'est pas sensible aux pH. En outre, la fluorescence des deux FAM et TAMRA peut être analysé séparément car elles ne se chevauchent pas de manière significative. La détermination du rapport de la fluorescence de emission de deux colorants à des longueurs d'onde spécifiques donne une réponse de pH indépendant d'autres conditions environnementales. Les échafaudages d'auto-déclaration pourraient permettre l'évaluation de la répétition de pH in situ et en temps réel sans perturber le modèle 3D développé. Nous avons démontré que ces échafaudages sont capables de supporter la fixation et la prolifération cellulaire et restent sensibles à l'analyte en question. La cinétique de sous-produits acides dans les constructions du génie reste peu étudié et en tant que tel en utilisant les réactifs pH échafaudages peuvent considérablement faciliter ces études 19. En outre, l'utilisation des échafaudages d'auto-déclaration pour les applications d'ingénierie tissulaire présente la possibilité de comprendre, surveiller et optimiser la croissance de modèle constructions de tissu 3D in vitro, de manière non invasive et en temps réel.
Les pH nanocapteurs sensibles ont également été livrés à l'environnement intracellulaire de fibroblastes cultivés sur électrofilé scaffol PLGAds. Le ratio de l'émission de fluorescence à partir des colorants ont été utilisés pour surveiller le pHi et comparée à un échafaudage nanocapteurs Incorporation de pH d'auto-vérification. La livraison des nanocapteurs de cellules cultivées dans un environnement 3D peut permettre la surveillance de la concentration de substance à analyser en profondeur dans le produit d'assemblage d'une manière non destructive. Par conséquent nanocapteurs peuvent être un outil d'imagerie viable pour évaluer de façon non destructive comportement des cellules tout au long de 3D construit permettant l'analyse à long terme. La sélection de la concentration en analyte de cellules individuelles au sein d'une construction 3D pourrait assurer qu'ils reçoivent en nutriments et en oxygène des concentrations suffisantes. paramètres du procédé de surveillance pourraient aider dans le développement de techniques normalisées pour le transport de masse efficace de l'oxygène et de nutriments. La livraison des nanocapteurs à l'environnement intracellulaire et l'incorporation de nanocapteurs dans échafaudages polymères pourrait être combinée à permettre l'évaluation de la viabilité des cellules ainsi que la performance de l'échafaudage dans const 3Dructs au cours du processus de croissance de tissu. Cela peut conduire à une meilleure connaissance de ces constructions et progresser la fabrication de produits de remplacement de tissus biologiques pertinents.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'ingénierie tissulaire aspire à créer des substituts biologiques pouvant être utilisé à la fois in vivo comme des modèles in vitro de tissus et dans la thérapie de remplacement de tissu à réparer, de remplacer, de maintenir ou d'améliorer la fonction d'un tissu ou d'un organe particulier. Substituts synthétiques ont été utilisés pendant de nombreuses années pour remplacer ou réparer des tissus de l'aide, mais ceux-ci échouent souvent en raison de la faible intégr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement du BBSRC est aimablement reconnu (numéro de subvention BB H011293 / 1).
Materials
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?. Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 – 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
