3 आयामी सेल संस्कृति के लिए स्वयं रिपोर्टिंग Scaffolds
Summary
Biocompatible पीएच उत्तरदायी जेल प nanosensors पाली (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA) electrospun scaffolds में शामिल किया जा सकता है. उत्पादित आत्म रिपोर्टिंग scaffolds पाड़ पर संवर्धन कोशिकाओं whilst के microenvironmental शर्तों के सीटू निगरानी में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 डी सेलुलर निर्माण प्रयोग परेशान बिना वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है के रूप में यह फायदेमंद है.
Abstract
उचित scaffolds पर 3 डी में संवर्धन कोशिकाओं बेहतर vivo में microenvironment नकल और सेल सेल बातचीत को बढ़ाने के लिए सोचा है. परिणामस्वरूप 3D सेलुलर निर्माण अक्सर 2D में अध्ययन इसी तरह के प्रयोगों से आणविक घटनाओं और सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए और अधिक प्रासंगिक हो सकता है. पाड़ भर में उच्च सेल व्यवहार्यता के साथ प्रभावी 3 डी संस्कृतियों बनाने के लिए इस तरह ऑक्सीजन और ध्यान से analyte एकाग्रता में ढ़ाल के रूप में नियंत्रित किया जा पीएच जरूरत के रूप में संस्कृति की स्थिति में 3 डी निर्माण के दौरान मौजूद कर सकते हैं. यहाँ हम पाली स्तनधारी कोशिकाओं की संस्कृति के लिए उनके बाद तैयारी के साथ (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA) electrospun scaffolds में biocompatible पीएच उत्तरदायी जेल प nanosensors और उनके समावेश तैयारी की विधियों का वर्णन. पीएच उत्तरदायी scaffolds एक 3 डी सेलुलर निर्माण के भीतर microenvironmental पीएच का निर्धारण करने के लिए उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, विस्तार पीएच उत्तरदायी nanose की डिलिवरी हमजिसका विकास electrospun PLGA scaffolds के द्वारा समर्थित किया गया स्तनधारी कोशिकाओं के intracellular पर्यावरण के लिए nsors. पीएच उत्तरदायी nanosensors के cytoplasmic स्थान चल रहे प्रयोगों के दौरान intracellular पीएच (पीएचआई) की निगरानी के लिए उपयोग किया जा सकता है.
Introduction
ऊतक इंजीनियरिंग में एक प्रमुख रणनीति जिसका आकारिकी इसे बदलने के लिए जा रहा है कि ऊतक जैसा दिखता है और यह भी सेल के विकास और समारोह 1,2 समर्थन करने में सक्षम है scaffolds के निर्माण के लिए biocompatible सामग्री का इस्तेमाल होता है. पाड़ सेल लगाव और प्रसार अभी तक एक 3 डी सेलुलर निर्माण की interstices भर में सेल प्रवास की अनुमति देता है की अनुमति देकर यांत्रिक सहायता प्रदान करता है. पाड़ भी सेल पोषक तत्वों की बड़े पैमाने पर परिवहन के लिए अनुमति देते हैं और चयापचय बर्बाद 3 को हटाने को बाधित नहीं करना चाहिए.
Electrospinning सेलुलर वृद्धि 4-6 समर्थन करने में सक्षम polymeric scaffolds के निर्माण के लिए एक होनहार पद्धति के रूप में उभरा है. वे अक्सर असुरक्षित हैं और एक 3 डी सेलुलर निर्माण 7 की interstices भर में सेल सेल बातचीत के साथ ही सेल प्रवास की अनुमति के रूप में उत्पादन nonwoven electrospun फाइबर सेल के विकास के लिए उपयुक्त हैं. यह टी के दौरान सेल व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण हैवह संस्कृति की अवधि और उस सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए 3 डी निर्माण की पूरी भर में बनाए रखा है. Analyte एकाग्रता में ढ़ाल 3 डी का निर्माण भीतर मौजूद कर सकते हैं के रूप में उदाहरण के लिए, जैसे ऑक्सीजन और पीएच के रूप में संस्कृति की स्थिति, सावधान नियंत्रण की आवश्यकता होती है. बायोरिएक्टर या छिड़काव सिस्टम बीचवाला प्रवाह के vivo परिस्थितियों में और एक परिणाम वृद्धि पोषक हस्तांतरण और चयापचय कचरे को हटाने के रूप में 8 की नकल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इस तरह की व्यवस्था लगातार microenvironmental स्थितियां सुनिश्चित कर रहे हैं के सवाल का वास्तविक समय में सेलुलर microenvironment का आकलन करने से संबोधित किया जा सकता है.
वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है कि कुंजी microenvironment मेट्रिक्स में शामिल हैं: तापमान, सेल मीडिया की रासायनिक संरचना, भंग ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड की एकाग्रता, पीएच, और आर्द्रता. इन मेट्रिक्स के, तापमान सबसे आसानी से सीटू जांच में उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. सामान्यतः में शेष सूचीबद्ध मेट्रिक्स की निगरानी के लिए तरीकेइसलिए Volve नमूना लेने के लिए एक विभाज्य को हटाने और सेल संस्कृति परेशान और प्रदूषण खतरे को बढ़ा. सतत, वास्तविक समय तरीकों की मांग की जा रही है. वर्तमान निगरानी तरीकों आमतौर पर शारीरिक रूप से इस तरह के एक पीएच मॉनिटर या ऑक्सीजन जांच के रूप में सेलुलर निर्माण की जांच कि उपकरणों पर भरोसा करते हैं. हालांकि, इन घुसपैठ तरीकों सेलुलर निर्माण को नुकसान और चल रहे प्रयोग को परेशान कर सकते हैं. 3 डी का निर्माण भीतर analyte सांद्रता के noninvasive निगरानी ऐसे पोषक तत्व रिक्तीकरण 9 के रूप में विभिन्न पर्यावरणीय पहलुओं की वास्तविक समय की निगरानी सक्षम हो सकता है. इस ढांचे के भीतर गहरी क्षेत्रों के लिए पोषक तत्वों की आपूर्ति के मूल्यांकन की अनुमति है और चयापचय बर्बाद प्रभावी ढंग से 10,11 हटाया जा रहा था कि क्या यह निर्धारित होगा. Invasiveness के मुद्दे का समाधान करने का प्रयास है कि सिस्टम सामान्य तौर पर पीएच, ऑक्सीजन की निगरानी और 12 ग्लूकोज संस्कृति पोत दोनों के माध्यम से और बाहरी सेंसर करने के लिए संस्कृति के माध्यम से गुजरता है कि एक छिड़काव चैम्बर के इस्तेमाल को शामिल.पुन सीधे नमूना लेने के लिए एक विभाज्य को हटाने की आवश्यकता नहीं है और इस तरह के रूप में सीटू की निगरानी में प्रदान करेगा कि संस्कृति बर्तन में एकीकृत किया जा सकता है कि सेंसर को विकसित करने में रुचि बढ़ रही है.
सीटू और हम स्वयं रिपोर्टिंग scaffolds के 13 निर्माण करने के लिए electrospun scaffolds में analyte उत्तरदायी nanosensors शामिल किया है microenvironmental शर्तों के noninvasive निगरानी में के लिए इस तरह की कमियों को संबोधित करने के लिए. संवेदन डिवाइस electrospinning द्वारा या पूर्व पाड़ गठन 14,15 बहुलक में शामिल किया है जो एक analyte संवेदनशील डाई के प्रयोग के माध्यम से बनाया वास्तविक polymeric पाड़ या तो था जहां प्रतिदीप्ति गतिविधि की निगरानी के द्वारा के रूप में संवेदी उपकरणों कि अधिनियम scaffolds, पहले से तैयार किया गया है . हालांकि, इन संवेदी उपकरणों अन्य analytes से संभावित हस्तक्षेप की वजह से गलत ऑप्टिकल outputs देने की क्षमता है. एक ratiometric संवेदन डिवाइस सु का उपयोगवर्णित प्रोटोकॉल में तैयार उन के रूप में चर्चा इन संभव प्रतिकूल प्रभाव को खत्म करने और प्रश्न में analyte के लिए विशिष्ट एक प्रतिक्रिया प्रदान करने की क्षमता रखती है.
यहाँ प्रस्तुत electrospun scaffolds के कारण चयनित, सिंथेटिक सह बहुलक पाली (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA) से तैयार किया गया है खाद्य एवं औषधि इसके biodegradable और biocompatible गुणों के कारण प्रशासन (एफडीए) की मंजूरी, और एक ट्रैक होने विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 16-18 के विकास और समारोह का समर्थन करने का रिकॉर्ड है. तैयार ratiometric analyte उत्तरदायी nanosensors पीएच के लिए उत्तरदायी हैं. nanosensors एक डाई, परिवार पीएच को उत्तरदायी और अन्य है, जहां एक biocompatible प मैट्रिक्स जेल में दो फ्लोरोसेंट रंगों को शामिल सूत्रों का कहना है कि यह पीएच के लिए उत्तरदायी नहीं है के रूप में एक आंतरिक मानक के रूप में कार्य करता है. वे काफी ओवरलैप नहीं है के रूप में इसके अलावा परिवार और Tamra दोनों की प्रतिदीप्ति अलग से विश्लेषण किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति ईएमआई के अनुपात का निर्धारणविशिष्ट तरंगदैर्य पर दोनों रंगों के ssion अन्य पर्यावरणीय स्थितियों के स्वतंत्र पीएच प्रतिक्रिया देता है. आत्म – रिपोर्टिंग scaffolds विकसित 3 डी मॉडल में खलल न डालें बिना बगल में और वास्तविक समय में पीएच का दोहरा मूल्यांकन अनुमति दे सकता है. हम इन scaffolds सेल लगाव और प्रसार का समर्थन करने में सक्षम हैं और प्रश्न में analyte के लिए उत्तरदायी रहते हैं कि प्रदर्शन किया है. इंजीनियर निर्माणों में द्वारा उत्पादों अम्लीय के कैनेटीक्स understudied बनी हुई है और इस तरह के रूप में पीएच उत्तरदायी scaffolds का उपयोग बहुत तरह के अध्ययन में 19 की सुविधा सकता है. इसके अलावा, ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए आत्म – रिपोर्टिंग scaffolds के उपयोग का अवसर पूरी तरह से समझने की निगरानी और इन विट्रो में 3 डी मॉडल ऊतक निर्माणों का विकास, noninvasively और वास्तविक समय में अनुकूलन करने के लिए प्रस्तुत करता है.
पीएच उत्तरदायी nanosensors भी electrospun PLGA scaffol पर सुसंस्कृत fibroblasts के intracellular पर्यावरण के लिए दिया गया हैडी एस. रंगों से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का अनुपात फ़ाई पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया और एक आत्म रिपोर्टिंग पाड़ शामिल पीएच nanosensors की तुलना में थे. एक 3 डी वातावरण में संवर्धित कोशिकाओं को nanosensors के वितरण गहरी एक nondestructive ढंग से निर्माण के भीतर analyte एकाग्रता की निगरानी सक्षम हो सकता है. इसलिए nanosensors nondestructively 3D भर में सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए एक व्यवहार्य इमेजिंग उपकरण लंबी अवधि के विश्लेषण की अनुमति constructs हो सकता है. एक 3 डी निर्माण के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं की analyte एकाग्रता स्क्रीनिंग वे पर्याप्त पोषक तत्व और ऑक्सीजन सांद्रता प्राप्त कर रहे हैं कि सुनिश्चित कर सके. निगरानी प्रक्रिया पैरामीटर ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की प्रभावी जन परिवहन के लिए मानकीकृत तकनीक के विकास में सहायता कर सकता है. intracellular वातावरण और polymeric scaffolds में nanosensors का समावेश करने के लिए nanosensors के वितरण 3D const भीतर सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के साथ ही पाड़ प्रदर्शन की अनुमति के लिए जोड़ा जा सकता हैऊतक विकास की प्रक्रिया के दौरान ructs. यह इन निर्माणों की वृद्धि हुई ज्ञान के लिए नेतृत्व और जैविक रूप से प्रासंगिक ऊतक के विकल्प का निर्माण प्रगति कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
टिशू इंजीनियरिंग एक विशेष ऊतक या अंग के समारोह में सुधार करने की जगह, को बनाए रखने या बढ़ाने के लिए इन विट्रो ऊतक मॉडल की तरह vivo में और ऊतक प्रतिस्थापन चिकित्सा में दोनों के रूप में इस्तेमाल किया ज…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
बीबीएसआरसी से अनुदान कृपया स्वीकार किया है (अनुदान संख्या बी बी H011293 / 1).
Materials
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?. Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 – 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
