Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток
Summary
Биосовместимые рН реагирующие наносенсоры золь-гель могут быть включены в поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA) electrospun леса. Полученные самоотчетности леса могут быть использованы для мониторинга в месте из микроокружения условиях в то время культивирования клеток на эшафот. Это выгодно, поскольку 3D сотовой конструкцией можно контролировать в реальном времени без нарушения эксперимент.
Abstract
Культивирования клеток в 3D на соответствующих строительных лесов, как полагают, лучше имитировать в естественных условиях микросреды и увеличить межклеточные взаимодействия. В результате 3D сотовой конструкцией часто может быть более актуальными для изучения молекулярных событий и межклеточные взаимодействия, чем аналогичных экспериментов, изучаемых в 2D. Чтобы создать эффективные 3D культуры с высокой жизнеспособностью клеток по всему помост Условия культивирования, такие как кислород и рН в необходимости тщательно контролировать как градиенты концентрации анализируемого вещества может существовать во всем 3D конструкции. Здесь описаны способы получения биосовместимых рН реагирующие наносенсоры золь-гель и их включение в поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA) electrospun леса вместе с их последующей подготовки к культуре клеток млекопитающих. РН реагирующие каркасы могут быть использованы в качестве инструментов для определения микроокружения рН в 3D-сотовой конструкции. Кроме того, мы подробно доставку рН реагировать nanosensors к внутриклеточной среде клеток млекопитающих, рост был поддержан electrospun лесов ПМГК. Цитоплазматический расположение рН реагирующих наносенсоры могут быть использованы для мониторинга внутриклеточного рН (PHI) во время выполнения экспериментов.
Introduction
Ключевая стратегия в тканевой инженерии является использование биосовместимых материалов для изготовления строительных лесов, чьи морфология напоминает ткань, что собирается заменить, а также способен поддерживать рост и функцию 1,2 клеток. Каркас обеспечивает механическую опору, позволяя вложение и пролиферации клеток еще позволяет миграцию клеток по всему промежутках 3D-сотовой конструкции. Леса также должны позволить для массового транспорта клеточных питательных веществ, а не препятствовать удаление метаболические отходы 3.
Электропрядения возник как перспективный метод для изготовления полимерных строительных лесов, способных поддерживать клеточную 4-6 роста. Нетканые electrospun волокна, полученные подходят для роста клеток, поскольку они часто пористыми и обеспечения взаимодействия клетка-клетка, а также миграцию клеток в течение промежутках между 3D сотовой конструкции 7. Важно контролировать жизнеспособность клеток в течение тон Период культуры и обеспечить, чтобы жизнеспособность клеток сохраняется в течение всей 3D конструкции. Например, условия культивирования, такие как кислород и рН требуют тщательного контроля, как градиенты в концентрации анализируемого вещества могут существовать в 3D конструкции. Биореакторы или перфузии системы могут быть использованы, чтобы имитировать в естественных условиях интерстициального потока и, как результат передачи увеличение питательных веществ и удаление отходов метаболизма 8. Вопрос о том, такие системы обеспечения постоянные микросреды условия могут быть решены путем оценки клеточного микроокружения в режиме реального времени.
Основные показатели микроокружение, которые могут контролироваться в режиме реального времени, включают: температуру, химический состав клеточных сред, концентрации растворенного кислорода и углекислого газа, рН и влажности. Из этих показателей, температура может быть наиболее легко контролируется с использованием в точке зондов. Методы мониторинга оставшиеся перечисленные показатели обычно вУдаление Volve аликвоты для отбора проб и, следовательно, нарушить культуры клеток и увеличить риск загрязнения. Непрерывные, методы реального времени в настоящее время изыскиваются. Современные методы мониторинга, как правило, полагаются на инструменты, которые физически исследовать сотовую конструкцию, например монитор рН или кислорода зонда. Тем не менее, эти навязчивые методы могут повредить клеточную конструкцию и нарушить текущий эксперимент. Неинвазивная мониторинг концентрации анализируемых в рамках 3D конструкции может позволить мониторинг в реальном времени различных экологических аспектов, таких как питательной истощения 9. Это позволило бы оценку питательных веществ в более глубокие регионов в структуре и определить, был ли метаболические отходы удаляются эффективно 10,11. Система, призванная решить проблему инвазии как правило, предполагает использование камеры перфузии, которая проходит культуральной среды как через сосуда для культивирования и внешних датчиков для мониторинга рН, кислорода и глюкозы 12.вновь растет интерес к разработке датчиков, которые могут быть непосредственно интегрированы в культурную судна, которые не требуют удаления аликвоты для отбора проб и как таковая будет обеспечить в мониторинге месте.
Для решения таких недостатков для на месте и неинвазивной мониторинга микроокружения условиях мы включили анализируемого отзывчивые наносенсоров в electrospun лесов для производства самоотчетности строительных лесов 13. Леса, которые действуют как устройства зондирования путем мониторинга флуоресценции активность была подготовлена заранее, где чувствительный элемент был или фактическое полимерный леса создан электропрядения или посредством использования аналита реагировать красителем, который включен в полимер перед формированием лесов 14,15 . Однако эти зондирования устройства имеют потенциал, чтобы дать ошибочные оптических выхода, вызванные возможной помех от других веществ. Использование логометрического сенсорного устройства суCH как полученные в описанном протокола имеет потенциал для устранения этих возможных негативных последствий и обеспечить специфическую реакцию с аналитом котором идет речь.
В electrospun леса, представленные здесь, были получены из синтетического сополимера поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA), выбран из-за наличия пищевых продуктов и медикаментов (FDA) утверждения, благодаря своей биоразлагаемых и биосовместимых свойств и дорожки запись поддерживать рост и функцию различных типах клеток 16-18. Подготовленные логометрический анализируемого отзывчивые наносенсоры реагируют на рН. В наносенсоры включать два флуоресцентных красителей в биосовместимого матрицы золь-гель, где один краситель, FAM является чувствительным к рН и с другой стороны, TAMRA действует в качестве внутреннего стандарта, поскольку это не реагируют на рН. Кроме того флуоресценция как FAM и TAMRA могут быть проанализированы по отдельности, поскольку они существенно не перекрывались. Определение отношение флуоресценции EMIssion обоих красителей при определенных длин волн дает ответа рН независимо от других условий окружающей среды. С собственной отчетности леса может позволить проведены повторные рН на месте и в режиме реального времени, не прерывая разработанный 3D модель. Мы показали, что эти строительные леса способны поддерживать прикрепление клеток и пролиферацию и продолжать реагировать с аналитом в вопросе. Кинетика кислой побочных продуктов в инженерных конструкций остается недостаточно изученной, и как таковой с использованием рН отзывчивые строительных лесов могло бы значительно облегчить такие исследования 19. Кроме того, использование само-отчетности лесов для тканевой инженерии представляет возможность в полной мере понять, контроля и оптимизации рост 3d модель ткани конструкций в пробирке, неинвазивно и в режиме реального времени.
РН отзывчивые наносенсоры также был доставлен с внутриклеточным среды фибробластов культивируемых на electrospun PLGA scaffolспуск. Отношение флуоресценции от красителей были использованы для контроля Пхи и по сравнению с самостоятельной отчетности лесов, включающих рН наносенсоров. Доставка наносенсоров для клеток, культивируемых в 3D-среде может позволить мониторинг концентрации анализируемого вещества глубоко внутри конструкции в неразрушающего образом. Поэтому наносенсоры может быть жизнеспособным инструментом визуализации для неразрушающего оценить поведение клеток на протяжении 3D строит позволяя долгосрочный анализ. Скрининг концентрации анализируемого вещества отдельных клеток в 3D-конструкции может гарантировать, что они получают достаточное количество питательных веществ и кислорода. Параметры процесса мониторинга может помочь в разработке стандартизированных методов для эффективного переноса массы кислорода и питательных веществ. Доставка наносенсоров с внутриклеточным окружающей среды и включения наносенсоров в полимерные лесов могут быть объединены, чтобы позволить оценку жизнеспособности клеток, а также производительность эшафот в 3D сопзructs в процессе роста тканей. Это может привести к увеличению знаний этих конструкций и прогрессировать изготовление биологически соответствующих заменителей тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тканевая инженерия стремится создать биологические заменители, которые могут быть использованы как в естественных условиях, как в пробирке моделей тканей и в заместительной терапии ткани для ремонта, замены, поддерживать или улучшать функцию определенной ткани или органа. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование из BBSRC любезно признал (номер гранта BB H011293 / 1).
Materials
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?. Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 – 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
