Bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması Uygulanan Hücrelerinin Permeabilization
Summary
Bu protokol, bir atıl gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelerin geçici nüfuziyet için bir yöntem tarif etmektedir. Bu teknik, plazma zarını bozan mekanik kuvvetlerin kullanılması ile yapışık memeli hücrelerine genetik malzeme ve biyomoleküllerin transferini kolaylaştırır.
Abstract
Çeşitli hücre transfeksiyon teknikleri var ve bu üç geniş kategoriye ayrılabilir: viral, kimyasal ve mekanik. Bu protokol, geçici olarak hücrelerin içine normal olarak geçirgen makromoleküllerin transferini kolaylaştırmak için bir inert gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelere nüfuz edilebilir kılınması için mekanik bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, mikro gözenek geçici oluşumu ile sonuçlanan, yapışkan hücrelerin plazma zarı üzerinde kesme kuvvetleri aktarmanın çalışır inanıyoruz. Bu gözenekler oluşturulur sonra, hücreler daha sonra, genetik madde ve diğer biyomoleküllerin geçirgendir. Kullanılan mekanik kuvvetlerin kendi alt-tabakaya kalıcı ya da zarar ayırma hücre riski yoktur. Teknik etkili olan atıl gaz dinamiği dar bir aralık, bu nedenle bulunmaktadır. Bir atıl gaz jet HeLa, HEK293 ve insan abdominal aort endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre çizgileri yapışkan geçirimli de etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, p için uygunbunun gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda potansiyel olarak araştırma ve kullanılabilir gösteren in vivo olarak gösterdiği gibi, in vitro ve hem de yapışık hücre ermeabilization. Ayrıca, değerli bir araştırma aracı olarak kanıtlamak olabilir ki, uzaysal olarak kısıtlayıcı bir şekilde hücrelerin geçirgenleştiren avantajına sahiptir.
Introduction
Biyotıbbın evrim ve hücre mekaniği anlayışı ile, hücre içine biyomoleküllerin teslim birçok araştırma alanları ve tıbbi tedaviler için hayati hale gelmiştir. Farklı teknikler plazma zarı ve hücre sitozolüne yabancı molekülleri tanıtmak için geliştirilmiştir. Viral, kimyasal ya da mekanik teknikler: Bunlar genellikle ya olarak sınıflandırılabilir. Viral teknikleri, viral vektörleri 1 kullanarak, RNA ve DNA gibi genetik malzemeyi transfekte olabilir. Viral teknikleri ancak bunlar immün ve enflamatuar reaksiyonlar 2 için potansiyel var, bazı hücre kuşaklarında yüksek verimliliğe sahip olma eğilimindedir. Genel kimyasal transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat 3, 4 bakteriyel ekzotoksin ve lipofeksiyon 5 ile çökelmesini içerir. Bu teknikler etkili olduğu kanıtlanmıştır, ancak bazı sorunlar, hücre toksisitesi ve non-özgüllük olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, bu tür kalsiyum fosfata gibi tekniklere nadiren çökelme primer hücrelerde 6, en fazla% 70, ancak sadece belli hücre hatlarında transfeksiyon verimliliği sahip olduğu tespit edilmiştir. Artan araştırma çabaları, özellikle klinik kullanımı ve DNA işleyişi çalışma için çeşitli tedaviler tasarımı durumunda, primer hücrelerin içine koymak ediliyor gibi bu notun olduğunu.
Mekanik uyarıcılara yoluyla hücre zarının zamansal bozulması hücre içine yabancı moleküllerin sokulması için bir alternatiftir. Teknikler şunlardır: molekül 7 mikroenjeksiyon, membran 8,9 bozmak için bir elektrik alanı kullanılarak elektroporasyon, sonoporation ile bağlı parçacıklar sürgünler "gen tabancası" ile gösterildiği gibi, hücre zarını, 10-12, partikül bombardımanı bozmak için ultrason dalgaları kullanarak hücrenin 13 içine genleri, ve son zamanlarda, memeli hücreleri geçici olarak 14,15 permeabilize gösterilmiştir akışkan kesme stresi uygulaması. Her ne kadar mekanikal yöntemleri yukarıda belirtilen sorunların bazılarını önlemek için, tipik olarak daha düşük verim ve son derece karmaşık ve uzman düzeneklerinin eşlik eder. Bir atmosferik basınçta ışıltılı tahliye meşale (APGD-t) yüzeyler işlevselleştirilmesiyle ve in vitro 16 yapışık hücreleri ayırmanın ilk hedefi ile McGill de geliştirilmiştir. Tesadüfen çok kullanılan canlı / ölü leke nasılsa bir geçirimli madde eklenmeden hücreleri tarafından alınan edildiğini keşfedildi. Ayrıca, bu sadece meşale yolu ile maç oldu kuyu kısıtlı alanlarda meydana gelmiş gibiydi. APGD-t permeabilization yetenekleri soruşturma devam etti ve kontrol çalışmaları, bu uyarımı olmadan plazma taşıyıcı atıl gaz püskürtüsü da permeabilize hücrelerin mümkün olduğu bulunmuştur. Bu plazma jeti tarafından oluşturulan reaktif türler geçici membran fonksiyonu bozulmuş ilk hipotezi çeliştiğini ve önerilen basit mekanik olduğunucal kuvvetler hücre geçirgenliği neden için yeterli idi. Buradan itibaren, çalışmalar denemek ve ölçmek ve Permeabilization inert gaz jetinin etkinliğin yanı sıra tranfeksiyon yetenekleri 16 bakmak karakterize bizim laboratuvarda devam etti.
Bu çalışmalar sayesinde, mikro-plazma membranında gerçek biçimde yapmak olduğu bulunmuştur ve bu gözeneklerin yaklaşık 5 saniye 15 içinde yeniden mühürlemek için eğilimindedir. Bir piliç embriyo koriyoalantoik zara in vitro ve in vivo olarak tekniğin yarar göstermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inert gaz jet permeabilizasyon yapışık hücre transfeksiyonu için yararlı bir tekniktir. Bu, zararlı kimyasal maddeler ya da viral vektörler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır mekanik kuvvetlerin kullanımı ile hücrelere biyomoleküllerin aktarma yeteneği sağlar. Teknik potansiyel araştırmacılara ve klinisyenlere hassas hücreleri transfect verimli ve nispeten basit bir yol verebilir. Nüfuziyet seçiciliği de araştırmacılar sadece çok uygulamalarda yararlı olabilir, tek bir koloni bazı hücrel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC): Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
