Permeabilizzazione delle cellule Aderito utilizzo di un gas inerte Jet
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per la permeabilizzazione temporanea di cellule aderenti mediante un getto di gas inerte. Questa tecnica facilita il trasferimento di materiale genetico e biomolecole in cellule di mammifero aderenti mediante l'utilizzo delle forze meccaniche di distruggere la membrana plasmatica.
Abstract
Esistono varie tecniche di trasfezione cellulare e questi possono essere suddivisi a tre grandi categorie: virale, chimici e meccanici. Questo protocollo descrive un metodo meccanico per permeabilize temporalmente cellule aderenti mediante un getto di gas inerte che può facilitare il trasferimento di normalmente macromolecole non permeabili nelle cellule. Crediamo che questa tecnica funziona impartendo forze di taglio sulla membrana plasmatica di cellule aderenti, causando la formazione temporanea di micropori. Una volta che questi pori sono creati, le cellule sono poi permeabile al materiale genetico e altre biomolecole. Le forze meccaniche coinvolte non corrono il rischio di cellule permanentemente danneggiare o staccano dal loro substrato. Esiste, quindi, una ristretta gamma di dinamica dei gas inerti dove la tecnica è efficace. Un getto di gas inerte è dimostrata efficace in permeabilizzante varie linee cellulari aderenti, compresi HeLa, HEK293 e cellule endoteliali dell'aorta addominale umani. Questo protocollo è appropriato per la permeabilization di cellule aderenti sia in vitro che, come abbiamo dimostrato, in vivo, mostrando esso può essere usato per la ricerca e potenzialmente in future applicazioni cliniche. Essa ha anche il vantaggio di permeabilizzante cellule in modo spazialmente restrittiva, che potrebbe rivelarsi un valido strumento di ricerca.
Introduction
Con l'evoluzione della biomedicina e la comprensione della meccanica delle cellule, la consegna di biomolecole nelle cellule è diventato di vitale importanza per molti settori di ricerca e le terapie mediche. Diverse tecniche sono state sviluppate per introdurre molecole estranee attraverso la membrana plasmatica e nel citoplasma cellulare. Questi possono essere generalmente classificati come: tecniche virale, chimici o meccanici. Tecniche virali possono trasfettare materiale genetico come RNA e DNA utilizzando vettori virali 1. Tecniche virali tendono ad avere alte efficienze in certe linee cellulari, tuttavia hanno il potenziale di reazioni immunitarie e infiammatorie 2. I metodi più comuni di transfezione chimici includono precipitazione con fosfato di calcio a 3, esotossine batteriche 4 e lipofezione 5. Queste tecniche hanno dimostrato di essere efficace, tuttavia, alcuni problemi sorgono come tossicità cellulare e non specificità. Inoltre, tecniche come phosphat calcioe precipitazione sono stati trovati per avere efficienze di trasfezione fino al 70%, ma solo in certe linee cellulari, raramente in cellule primarie 6. Questo è da notare come crescenti sforzi di ricerca sono stati messi in cellule primarie, soprattutto nel caso di progettazione di vari trattamenti per uso clinico e lo studio del funzionamento del DNA.
Interruzione temporale della membrana cellulare attraverso stimoli meccanici è un'alternativa per introdurre molecole estranee nelle cellule. Tecniche includono: microiniezione di molecole 7, elettroporazione usando un campo elettrico di distruggere la membrana 8,9, sonoporazione utilizzando onde ad ultrasuoni per distruggere la membrana cellulare 10-12, bombardamento di particelle come dimostrato dal "gene gun", che spara particelle legate con geni nella cella 13, e, più recentemente, l'applicazione di un fluido sforzo di taglio che ha dimostrato di permeabilize temporalmente cellule di mammifero 14,15. Sebbene meccanicometodi AL evitare alcuni dei problemi di cui sopra, sono in genere accompagnati da efficienze inferiori e configurazioni molto complesse e specializzate. Una torcia scarica a bagliore a pressione atmosferica (APGD-t) è stato sviluppato presso la McGill con l'obiettivo iniziale di funzionalizzazione di superfici e staccando le cellule aderenti in vitro 16. Casualmente, si è scoperto che una macchia dal vivo / morto utilizzato era in qualche modo essere presa in dalle cellule senza essere aggiunto un agente permeabile. Inoltre, questo sembrava si sono verificati solo in aree ristrette dei pozzi che è accaduto a corrispondere con il percorso della torcia. Da studi sulle capacità di permeabilizzazione della APGD-t proseguito in studi di controllo, è stato trovato che il gas di trasporto inerte getto di plasma senza eccitazione era anche in grado di permeabilize cellule. Questo contraddice l'ipotesi iniziale che le specie reattive create dal getto di plasma alterati temporaneamente la funzione della membrana e ha suggerito che semplicemente le meccanicheforze CAL erano sufficienti a causare permeabilizzazione cellulare. Da qui, gli studi continuarono nel nostro laboratorio per cercare di quantificare e caratterizzare l'efficienza permeabilizzazione di un getto di gas inerte come pure un'occhiata alle sue capacità di trasfezione 16.
Attraverso questi studi, si è scoperto che micropori costituiscano effettivamente nella membrana plasmatica, e questi pori tendono a richiudere entro circa 5 sec 15. Abbiamo dimostrato l'utilità della tecnica in vitro e in vivo nella membrana corioallantoidea di embrione di pollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Getto di gas inerte permeabilizzazione è una tecnica utile per la trasfezione di cellule aderenti. Offre la possibilità di trasferire biomolecole nelle cellule con l'uso di forze meccaniche, che elimina la necessità di prodotti chimici potenzialmente dannosi o vettori virali. La tecnica potrebbe potenzialmente offrire ai ricercatori e medici un modo efficiente e relativamente semplice per transfettare con precisione le cellule. La selettività del permeabilizzazione è unico anche consentendo ai ricercatori di tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), le scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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