Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure
Summary
Een gewijzigde tweefasige collagenase perfusie procedure voor isolatie van humane hepatocyten is beschreven. Deze methode kan ook worden toegepast op andere zoogdieren levers. De geïsoleerde hepatocyten zijn beschikbaar in hoge opbrengst en haalbaarheid, waardoor ze een geschikt model voor wetenschappelijk onderzoek op gebieden zoals lever regeneratie, farmacokinetiek en toxicologie.
Abstract
De lever, een orgaan met een uitzonderlijk regeneratiecapaciteit, voert een groot aantal functies, zoals ontgifting, metabolisme en homeostase. Als zodanig, hepatocyten zijn een belangrijk model voor een grote verscheidenheid van vraagstellingen. Met name het gebruik van menselijke hepatocyten is bijzonder belangrijk op het gebied van farmacokinetica, toxicologie, leverregeneratie en translationeel onderzoek. Aldus stelt deze werkwijze een gemodificeerde versie van een tweefasige collagenase perfusie procedure hepatocyten te isoleren zoals beschreven door Seglen 1.
Eerder hebben hepatocyten werden geïsoleerd door mechanische methoden. Echter enzymatische werkwijzen aangetoond superieur als hepatocyten behouden hun structurele integriteit en functie na isolatie. De hier gepresenteerde methode past de werkwijze eerder ontworpen rat lever menselijke lever stukken en resulteert in een grote opbrengst van hepatocyten met een levensvatbaarheid van 77 ± 10%. De belangrijksteverschil in deze procedure is het proces van cannulization van de bloedvaten. Verder kan de beschreven werkwijze ook toegepast worden levers van andere soorten met vergelijkbare lever of bloedvat maten.
Introduction
Een lever celsuspensie kan worden bereid uit de lever door mechanische of enzymatische werkwijzen. Mechanische methoden gebruikt om hele levercellen bereiden omvatten waardoor de lever door kaasdoek 2, schudden van een lever stuk met glazen kralen in een Kahn shaker 3, het gebruik van glas homogeniseerders met losse stampers 4,5 etc. In de loop der jaren zijn mechanische methoden van gevallen gunst vanwege de schade aan celmembranen en functieverlies van de geïsoleerde hepatocyten 6,7. Bijgevolg is het gebruik van een enzymatische Tegenwoordig is de belangrijkste methode voor isolatie van de hepatocyten.
Isolatie van hepatocyten met behulp van een enzymatische methode is sterk verbeterd toen Berry en vriend 8 doorbloed collagenase en hyaluronidase door de lever via de poortader in ratten. Dit perfusieproces gebruikt de vasculatuur om de enzymen in nauw contact met de meerderheid van de cellen te komen, waardooreen 6-voudige toename in opbrengst van hepatocyten 8. Verder is deze methode leverde cellen die hun structurele integriteit behouden, met vrijwel geen verandering van endoplasmatisch reticulum in geïsoleerde blaasjes en geen mitochondriale schade 8.
Deze methode werd gewijzigd door Seglen 1, die een twee-staps procedure perfusie pionier voor levercel isolement. In deze procedure wordt de rattenlever geperfuseerd met een Ca2 + vrije buffer gevolgd door perfusie met collagenase buffer die Ca 2 + 1. De verwijdering van Ca2 + in de eerste stap helpt desmosomen verstoren, terwijl de toevoeging van Ca2 + in de tweede stap is vereist voor optimale collagenase activiteit 1,9.
Aangezien het gepubliceerde werk hierboven beschreven uitgevoerd bij ratten dit artikel beoogt een gewijzigde procedure die kan worden gebruikt voor isolatie van hepatocyten met hoge levensvatbaarheid van brom toneneen levers. Het gebruik van menselijke hepatocyten blijft belangrijk voor translationeel onderzoek en voor het valideren van experimenten met diermodellen. De menselijke lever stukken die in deze studie werden met toestemming van het bestuur overgenomen door de Human Tissue en Cell Research Foundation, een door de staat gecontroleerde non-profit stichting 10. Na een patholoog verwijderd wat nodig is voor diagnose, werden lever stukken vanuit het restmateriaal. Het weefsel afgezet door de patholoog was morfologisch gezond weefsel verkregen van resectie marges na leverresectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol resulteert in de isolatie van humane hepatocyten met een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid. Om dit te bereiken, is het belangrijk om te beginnen met een geschikt stuk lever. Het stuk van de lever moeten intact Glisson capsule op alle oppervlakken met uitzondering van 1 snijvlak hebben. Een andere belangrijke factor is de bepaalde partij collagenase worden gebruikt als verschillende partijen kan leiden tot grote verschillen in de levensvatbaarheid van hepatocyten na digestie 11. Daarom moeten v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mogelijk gemaakt door de Human Tissue en Cell Research Foundation, die menselijke weefsels voor onderzoek beschikbaar maakt. Financiële steun voor dit werk werd ontvangen van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (subsidie naam: Virtual Lever Netwerk, subsidie nummer: 0315759) en Hepacult GmbH. Onze dank gaat ook uit naar de technische assistenten van de Grosshadern Ziekenhuis weefselbank voor het verzamelen van de lever monsters en de technische assistenten van de Cell Isolation Core Faciliteit voor het uitvoeren van de lever perfusie en hepatocyten isolement. In het bijzonder willen we Natalja Löwen bedanken voor het aantonen van deze procedure in de video. Tot slot willen we Natalja Löwen en Edeltraud Hanesch bedanken voor het maken van de illustraties voor figuur 1 en de cijfers in het schematisch overzicht van de video.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology–head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The principles of humane experimental technique. , (1959).
