Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch
Summary
Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.
Abstract
Das Nervensystem wird oft als fest verdrahtete Komponenten des Körpers beschrieben, obwohl es ein deutlich Fluid Organsystem, die auf äußere Reize in einem konsistenten, stereotype Weise reagiert wird, während eine unglaubliche Flexibilität und Plastizität. Anders als das zentrale Nervensystem (ZNS), ist das periphere Nervensystem (PNS), der bedeutende Reparatur, aber wir haben gerade erst begonnen, die zellulären und molekularen Mechanismen, die diesem Phänomen zu regieren verstehen. Mit Zebrafisch als Modellsystem, haben wir die einmalige Gelegenheit, Paar regenerative Studien mit in-vivo-Bildgebung und Genmanipulation. Periphere Nerven sind von Axonen durch Schichten von Glia-und Bindegewebe umgeben sind. Axone von myelinisierenden oder nicht myelinisierenden Schwann-Zellen, was wiederum zu einer fascicle durch eine zelluläre Mantel genannt Perineurium gewickelt sind umhüllt. Nach einer Verletzung, haben erwachsene peripheren Nerven die bemerkenswerte Fähigkeit, remove beschädigt axonal Schutt und re-innervieren Ziele. Um die Rollen aller peripheren Gliazellen in PNS Regeneration zu untersuchen, beschreiben wir hier ein Axon Durchtrennung Assay, einen handelsüblichen Stickstoff-gepumpten Farbstoff-Laser verwendet, um motorischen Nerven im Live-transgenen Zebrafisch axotomize. Weiterhin beschreiben wir die Methoden zu koppeln diese Experimente zu Zeitraffer-Aufnahmen von verletzten Nerven und Kontrolle. Diese experimentelle Paradigma kann verwendet werden, um nicht nur zu beurteilen, welche Rolle die Gliazellen spielen in Nervenregeneration, kann aber auch die Plattform für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die das Nervensystem Reparatur regieren werden.
Introduction
Zebrafisch wurden ausführlich die Entwicklung des Nervensystems aufgrund ihrer optischen Transparenz studieren und einfache Transgenese, die, wenn sie gekoppelt ist, für spektakuläre Darstellung von dynamischen Zelle Verhaltensweisen in einem lebenden Embryo erlauben verwendet. Darüber hinaus, da Zebrafisch und Säugetieren fast alle Gene für die Bildung des Nervensystems, zelluläre und molekulare Informationen in diesem Modell Organismus gesammelt erforderlich zu teilen, ist direkt zuordenbar anderen Wirbeltieren. Obwohl unglaublich mächtig für neuronale Entwicklungsstörungen Studien haben die Zebrafisch und seine einzigartigen Eigenschaften das Potenzial, auch Aufklärung der Mechanismen, die zu erhalten und den Wiederaufbau des Nervensystems nach Verletzung. Zebrafisch-Larven behalten ihre Lichtdurchlässigkeit in den späten Larvenstadien und Pigmentflecken können effektiv entweder mit dem Einsatz von pharmakologischen Inhibitoren der Melanin-Produktion oder genetische Mutanten, die Pigmentzellen fehlen gesperrt. So, mit diesem Modell Organismus studieren Verletzungen und Regeneration bei älteren Tieren ist möglich und bietet die einmalige Gelegenheit, direkt zu untersuchen, die zellulären und molekularen Mechanismen, die das Nervensystem wieder aufzubauen. In diesem Manuskript, beschreiben wir, wie man effizient und reproduzierbar verletzen Nerven im PNS von Zebrafisch-Larven. Diese Verletzung Paradigma eignet sich zur Untersuchung nicht nur Degeneration, sondern auch die Reaktionen von peripheren Gliazellen und Immunzellen sowie die Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen während der Regeneration.
Die PNS ist ein komplexes Netzwerk von motorischen und sensorischen Nerven, die erforderlich sind, um Information zwischen dem zentralen Nervensystem (CNS) und der Haut, Organe und Muskeln des Körpers vorbei ist, so dass ein Organismus mit seiner Umgebung zu interagieren und zu überleben. Entlang dieser Nerven, periphere Glia, einschließlich myelinisierenden und nicht myelinisierenden Schwann-Zellen und perineurale Glia sowie Bindegewebe umhüllen die Axone und bilden schließlich die reife Nervenzellen. Verletzung dieser Nerven initiiert einen Prozess known als Wallerdegeneration 10. Dieser Mechanismus der axonalen Fragmentierung, Immun-Rekrutierung, Schutt Clearance und Regeneration ist sehr stereotyp und genetisch reguliert 1. Frühere Studien in Säugersystemen haben die Rollen von Schwann-Zellen während Nervendegeneration und Regeneration 1, 2, 6, 8 beschrieben. In diesen Studien von fixiertem Gewebe oder Zellkultur, Schwann-Zellen nicht nur Makrophagen zum Ort der Verletzung in Schutt Zwischenraum unterstützen eingestellt, sondern auch in Myelin Phagozytose selbst unterstützt. Während diese Studien gewesen unglaublich informativ, wir haben noch nie zuvor visualisiert Gliazellen Reaktionen auf periphere Axon Verletzung in vivo in Echtzeit und keine andere Studien haben den Zusammenhang zwischen den verschiedenen Klassen der peripheren Gliazellen während dieser Ereignisse untersucht.
In jüngster Zeit haben mehrere Labors Waller-Degeneration untersucht mit Zebrafisch und Laser-vermittelten Axon Verletzungen ähnlich dem, was wir hier beschreiben <sup> 4, 5, 7, 9. In einigen dieser Studien wurden oberflächliche sensorischer Axone in jungen Larven mit einem speziell angefertigten, Zwei-Photonen-konfokalen Mikroskop 4, 5, 9 axotomisierten. In einer anderen Studie, die sehr ähnlich zu unserem eigenen ist, wurden tiefer Axone im ventralen motorischen Nerven in 5 Tage alten Larven mit einem handelsüblichen Laser-Ablation System 7 durchtrennt. In diesen beiden Versuchsanordnungen, lag der Schwerpunkt auf Waller-Degeneration und beide Axone und Immunzellen wurden abgebildet. Um auf diesen Studien erweitern beschreiben wir verletzen Motor Axone in älteren Larven mit reifer, myelinisierten Nerven und Test die Antwort aller Nerven-assoziierten peripheren Gliazellen während Degeneration und Regeneration.
Um dies zu tun, wir durchschneiden motorischen Nerven in 6 und 7 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larven und visualisieren die Reaktionen der einzelnen Gliazellen Populationen sowie untersuchen die Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen entlang verletzten Axone. Mit Doppel-und Dreifach-transgenic Linien dieses Etikett peripheren Gliazellen, einschließlich Schwann-Zellen und Perineuralzellen Gliazellen, sowie als Marker für Axone, verwenden wir ein handelsübliches Laser-Ablation, bestehend aus einem Stickstoff-gepumpter Farbstofflaser (Wellenlänge 435 nm), die an einer sich drehenden Scheibe Konfokalsystem zu Axon Querschnitten erhalten erstellen. Dieser Versuchsaufbau erlaubt es uns, Live, Larven Zebrafisch visualisieren, zu verletzen spezifischen peripheren motorischen Axon Traktate und Zeitraffer-Bild die Antworten der verschiedenen Gliazellen Populationen Axon Verletzungen und ihre Beziehung zueinander. Dieses Protokoll kann weiter angepasst werden, um Nervenverletzungen im Zebrafisch unterschiedlichen Alters zu schaffen, mit verschiedenen transgenen Linien oder genetische Mutanten, verschiedene wissenschaftliche Fragen zu beantworten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte des experimentellen Designs sind: 1) ordnungsgemäß Montage Larven für Verletzungen und anschließende in-vivo-Bildgebung und 2) die Kalibrierung des Lasers und die Auswahl der richtigen Energie-Einstellungen, um eine saubere Nervendurchtrennung schaffen, dass die Ergebnisse in minimal extra Gewebeschäden . Um eine erfolgreiche Axotomie für in-vivo-Bildgebung und die anschließende Analyse, montieren mehrere Larven entweder in einzelnen Petrischalen mit Glasboden oder in ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Kucenas Lab für wertvolle Diskussionen und Quorum Technologies, Inc. für hervorragende technische Unterstützung danken. Die Arbeit wurde von der UVa Fund for Excellence in Science and Technology (FEST) (SK) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
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