חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות
Summary
למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.
Abstract
מערכת העצבים מתוארת לעתים קרובות כמרכיב ומקודד היטב בגוף גם אם היא מערכת איברים במידה ניכרת נוזל שמגיבה לגירויים חיצוניים, באופן עקבי, סטריאוטיפי, תוך שמירה על גמישות ופלסטיות מדהימה. בניגוד למערכת העצבים המרכזי (CNS), מערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי, אבל אנחנו רק עכשיו התחלנו להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש בדג זברה כמערכת מודל, יש לנו הזדמנות חסרת תקדים לכמה מחקרי משובי עם in vivo הדמיה ומניפולציה גנטית. עצבים היקפיים מורכבים מהאקסונים מוקפים בשכבות של גליה ורקמות חיבור. אקסונים הensheathed ידי myelinating או אי myelinating-תאי שוואן, שהם בתורם עטוף לתוך fascicle ידי נדן סלולרי נקרא perineurium. בעקבות פציעה, יש עצבים היקפיים למבוגרים יכולת יוצאת דופן לרמהפגום יש פסולת axonal ומטרות מחדש innervate. כדי לחקור את התפקידים של כל גליה ההיקפית בהתחדשות PNS, אנו מתארים כאן assay חיתוך רוחב האקסון המשתמש בליזר צבע זמין מסחרי חנקן נשאב לaxotomize עצבים מוטוריים בדג זברה מהונדס חי. בנוסף, אנו מתארים את השיטות לכמה ניסויים אלה לזמן לשגות הדמיה של עצבים פגועים ושליטה. פרדיגמה ניסויית זה יכול לשמש לא רק כדי להעריך את התפקיד שמחזה גליה בהתחדשות עצב, אבל יכול להיות גם הפלטפורמה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים תיקון מערכת עצבים.
Introduction
דג הזברה נעשתה שימוש נרחב ללמוד פיתוח של מערכת העצבים בגלל השקיפות האופטית שלהם וקלות transgenesis, שכאשר יחד, לאפשר הדמיה מרהיבה של התנהגויות תא דינמיות בעובר חי. בנוסף, משום שדג זברה ויונקים חולקים כמעט את כל הגנים הדרושים להיווצרות מערכת עצבים, מידע תאי ומולקולרי שנאסף באורגניזם המודל הזה הוא שאפשר להתייחס באופן ישיר לבעלי חוליות אחרים. אמנם רב עוצמה למחקרים התפתחותיים עצביים, דג הזברה והתכונות הייחודיות שלה יש פוטנציאל גם להבהיר את המנגנונים ששומרים ולבנות מחדש את מערכת העצבים לאחר פציעה. זחלי דג הזברה לשמור על השקיפות שלהם לשלבים מאוחרים של זחל ופיגמנטציה ניתן לחסום ביעילות גם עם השימוש במעכבים פרמקולוגיים של ייצור המלנין או מוטציות גנטיות שאין תאי פיגמנט. כך, באמצעות אורגניזם מודל זה ללמוד פציעה וregeneratיון בבעלי חיים מבוגרים יותר אפשרי ומציע הזדמנות הייחודית לחקור ישירות את המנגנונים התאיים ומולקולריים שלשקם את מערכת העצבים. בכתב יד זה, אנו מתארים כיצד ביעילות ובreproducibly לפגוע בעצבים בPNS של זחלי דג הזברה. הפרדיגמה פגיעה זו משאיל את עצמו ללימוד לא רק התנוונות, אלא גם את התגובות של גליה היקפית ותאים של מערכת חיסון, כמו גם את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה במהלך התחדשות.
את PNS הוא רשת מורכבת של עצבים תחושתיים ומוטורי שיש צורך להעביר מידע בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואת העור, איברים והשרירים בגוף, המאפשר לאורגניזם כדי אינטראקציה עם סביבתו ולשרוד. לאורך העצבים האלה, גליה היקפית, כולל תאי myelinating ולא myelinating-שוואן וגליה perineurial, כמו גם רקמות חיבור, לשים בארגז את האקסונים והסוף של דבר יוצר את העצב הבוגר. פציעה של עצבים אלה יוזמת תהליך kNown כWallerian ניוון 10. מנגנון זה של פיצול axonal, גיוס חיסונית, שחרור מפסולת והתחדשות הוא מאוד סטריאוטיפי וגנטי מוסדר 1. מחקרים קודמים במערכות יונקים שתיארתי את התפקידים של תאי שווא במהלך הניוון עצבי ו1 ההתחדשות, 2, 6, 8. במחקרים של רקמות קבועה או תרבית תאים הללו, תאי שוואן גויסו לא רק מקרופאגים לאתר פציעה כדי לסייע בפינוי פסולת, אלא גם סייעו במיאלין phagocytosis עצמם. בעוד שמחקרים אלה היו אינפורמטיבי מאוד, יש לנו שלא היו מעולם תגובות גליה מדמיינים לפציעת האקסון ההיקפית in vivo בזמן אמת, ולא מחקרים אחרים בדקו את הקשר בין המעמדות של גליה היקפית השונות במהלך אירועים אלה.
לאחרונה, מספר מעבדות חקרו ניוון Wallerian באמצעות דג הזברה ופציעת האקסון לייזר בתיווך דומה למה שאנו מתארים כאן <sup> 4, 5, 7, 9. בחלק מהמחקרים אלה, האקסונים חושיים שטחיים היו axotomized בזחלים צעירים באמצעות מובנה מותאם אישית, מיקרוסקופ 4 שני הפוטונים confocal, 5, 9. במחקר אחר, שהוא מאוד דומה לשלנו, האקסונים עמוקים בתוך העצב המוטורי הגחון היו transected בזחלים בן 5 יום באמצעות מערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי 7. בשתי להגדיר קופצים הניסיוניים הללו, הדגש היה על ניוון Wallerian ושני האקסונים ותאים חיסוניים הם צלמו. להרחבה על מחקרים אלה, שאנו מתארים פציעת אקסונים מוטוריים בזחלים מבוגרים עם, עצבי myelinated בוגרים יותר וassay התגובה של כל גליה עצבים ההיקפית הקשורים בניוון והתחדשות.
כדי לעשות זאת, אנחנו transect עצבים מוטוריים ב6 ולאחר הפריה 7 יום (DPF) זחלים ולדמיין את התגובות של אוכלוסיות גליה בודדות, כמו גם לחקור את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה לאורך אקסונים פגועים. באמצעות טרה כפולה ומשולשתקווי nsgenic שגליה היקפית תווית, כולל תאי שוואן וגליה perineurial, כמו גם כסמן לאקסונים, אנו משתמשים במערכת אבלציה לייזר זמינה מסחרי בהיקף של חנקן נשאב צבע לייזר (אורך הגל nm 435) המחובר למערכת confocal דיסק ספינינג כדי ליצור transections האקסון. זה מאפשר ניסיוני הגדרתנו לדמיין חיה דג הזברה, הזחל, לפגוע בשטחים ספציפיים היקפיים מוטוריים האקסון וזמן לשגות תמונה את התגובות של אוכלוסיות שונות גלייה לפציעת האקסון ומערכת היחסים שלהם אחד לשנייה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם יותר ליצירת פציעות עצב בדג זברה בגילים שונים, עם קווים מהונדסים שונים או מוטציות גנטיות כדי לענות על שאלות מדעיות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר של עיצוב ניסיוני זה הם: 1) כמו שצריך זחלים גובר על פגיעה ולאחר מכן in vivo הדמיה ו2) כיול לייזר ובחירת הגדרות צריכת החשמל הנכונה על מנת ליצור חיתוך רוחב עצב נקי שגורם לנזק נוסף רקמות מינימאלית . כדי להבטיח axotomy מוצלח בתחום ההדמיה vivo ונית?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למעבדת Kucenas לדיונים חשובים וQuorum Technologies, Inc לתמיכה טכנית מעולה. העבודה נתמכה על ידי הקרן למצוינות בUVa מדע והטכנולוגיה (FEST) (SK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O’Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O’Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
