모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

Summary

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

Abstract

놀라운 유연성과 가소성을 유지하면서, 일관성, 틀에 박힌 방식으로 외부 자극에 반응 상당히 유동성 장기 시스템에도 신경 시스템은 종종 신체의 하드 와이어드 구성 요소로 설명되어 있습니다. 중추 신경계와는 달리 (CNS), 말초 신경계 (PNS)는 중요한 수리를 할 수있다, 그러나 우리는 단지이 현상을 제어하는​​ 세포와 분자 메커니즘을 이해하기 시작했다. 모델 시스템으로 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 생체 내 이미징 및 유전자 조작에 함께 부부 재생 연구에 전례없는 기회를 가질 수있다. 말초 신경은 아교 세포와 결합 조직의 층에 의해 둘러싸인 축삭으로 구성되어 있습니다. 축삭은 perineurium라는 세포 칼집에 의해 다발에 싸여 차례에 슈반 세포를 수초 또는 비 수초에 의해 ensheathed 있습니다. 부상 다음, 성인 말초 신경 레모 놀라운 능력을 가지고적 축삭 파편과 다시 신경을 분포시키다 목표를 손상. PNS 재생에있는 모든 주변 교세포의 역할을 조사하기 위해, 우리는 여기에 살고 형질 전환 제브라 피쉬의 운동 신경을 axotomize하기 위해 상업적으로 이용 가능한 질소 펌프 색소 레이저를 사용하는 축삭 절개 분석을 설명합니다. 우리는 더 이상 부상 및 제어 신경의 시간 경과 영상에이 실험 커플 방법을 설명합니다. 이 실험 패러다임은 아교 세포의 신경 재생에 재생, 그러나 또한 신경계 복구를 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해명을위한 플랫폼이 될 수있는 역할을 평가하지하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

제브라 피쉬 때문에 그들의 광학 투명 신경계의 발달을 연구하고 transgenesis의 용이성, 그 결합 할 때, 생활 배아에서 동적 세포 행동의 멋진 영상을 허용하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 제브라 피쉬와 포유류는 거의 모든 신경계 형성이 모델 생물에서 수집 한 세포 및 분자 정보에 필요한 유전자 공유하기 때문에 또한, 다른 척추 동물 종에 직접 논리적 인 사람이어야합니다. 신경 발달 연구를위한 매우 강력한 있지만, 제브라 피쉬와 독특한 속성은 또한 손상 후 신경 시스템을 유지하고 다시 메커니즘을 규명 할 수있는 잠재력이있다. Zebrafish의 유충 늦은 애벌레 단계로 자신의 반투명을 유지하고 색소 침착을 효과적으로 멜라닌 생산 또는 색소 세포가 부족한 유전자 돌연변이의 약물 억제제의 사용도 함께 차단 될 수 있습니다. 따라서,이 모델 생물을 사용하면 부상 및 regenerat을 연구하는세 동물의 이온이 가능하고, 직접 신경 시스템을 다시 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 독특한 기회를 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 효율적이고 재현성 zebrafish의 애벌레의 PNS의 신경을 손상하는 방법에 대해 설명합니다. 이 부상 패러다임은 주변 glia의 면역 세포의 반응뿐만 아니라, 재생하는 동안이 인구 사이의 상호 작용도 변성뿐만 아니라 공부에 자신을 준다, 그러나.

Protocol

1. 절제와 라이브 영상을위한 준비 및 제브라 피쉬 배아의 설치

1. 계란 물에 0.8 % 낮은 용융 아가로 오스의 주식을 준비한다. 필요한 ° C까지 4에서 13X 100mm 처분 할 수있는 문화 튜브 및 저장소로 나누어지는.
2. 찬란 모터 뉴런과 관심의 아교 세포 유형 레이블을 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 포함하는 크로스 성인 zebrafish의. 올바른 준비를위한 ° C 배양기 ³ 이후 28.5 달걀 물과 장소에 제브라 피쉬 배아를 수집합니다.
3. 약 24 시간 포스트 수정 (HPF)에서 계란 물을 제거하고 계란 물에 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU) 0.002 %를 추가합니다. 인큐베이터에 배아를 반환합니다.
4. 24 96 HPF 사이에, 배아는 형광 해부 범위에서 원하는 형질 전환 유전자의 존재에 대한 검사를해야한다. 신선한 PTU 계란 물에 선택된 배아를 놓고 인큐베이터로 돌아갑니다.
5. 유충 6 일 게시물 수정 (DPF) (또는 원하는 나이)에 도달하면, 인큐베이터에서 제거, 설치에 대한 몇 가지 유충을 선택하고, 작은 접시로 전송할 수 있습니다.
6. 접시에서 물을 제거하고 즉시 PTU 달걀 물에 약 0.02 % Tricane로 교체합니다. 유충은 약 ....

Results

여기에 설명 된 분석은 생체 내에서 축삭 손상에 glial 세포와 다른 신경 관련 세포 집단의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 영화 1이 방법과 glial 세포를 둘러싼의 응답을 사용하여 만든 신경 손상의 예를 보여줍니다. 이 실험은 (nkx2.2a : megfp) 전이에서 수행되었다 전이 (olig2 :는 DsRed) 제브라 피쉬, perineurial의 glia은 EGFP와 모터 뉴런 표현 세포질이 DsRed를 대상으로 멤브레인을 표현하는합니다. 부상은 6 DPF 라이브 제브라 피쉬의 트렁크 모터 신경의 주동이의 돌기를 따라했고, 신경 이후 EGFP와 DsRed를 채널 모두에서 이미지가 시간 경과이었다. 축삭과 아교 세포 행동이 허용 동시 시각화는 즉시 부상을 따라.

그림 1은 여전히 영화 1에서 가져온 정적 시간 점의 이미지를 보여줍니다. .......

Discussion

이 실험 설계의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 생체 내 이미징 및 2 부상 이후 제대로 설치 유충) 깨끗한 신경 절개를 만들기 위해 레이저를 교정하고 올바른 전원 설정을 선택하는 최소한의 추가 조직 손상의 결과 . 생체 내 이미징 및 이후의 분석을위한 성공 axotomy을 보장하기 위해, 각각의 유리 바닥 요리 중 하나 또는 칸막이 유리 바닥 접시에 여러 유충을 마운트합니다. 레이저 교정 후에, 우리는 신경 절개에 대한 최적의 매개 변수를 식별하기 위해 테스트 유충에 다른 전원 설정을 테스트하는 것이 좋습니다. 레이저는 레이저가) 유지 보수 또는 5 필요) 정확히 4 보정되지 않음) 3, 다른 나이의 1) 유충)가 제대로 2 마운트되지 않은 유충이 사용됩니다 : 이러한 설정은 일반적으로 실험 사이에 상당히 일관성이 있지만, 경우 변경할 수 있습니다 신경이 될 것입니다 매우 다른 전후방 위치에있는 경우조직의 두께에 차이가있다. 최적의 신경 절개는 2 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenylthiourea	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
저 융점 아가로 스	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview 세포 배양 접시, 유리 바닥, 멸균, Greiner Bio One	VWR / Greiner	89125-444
단일 우물 유리 바닥 페트리 접시 35 x 10mm, 12mm 두께	의 Willco Wells	GWSt-3512
MicroPoint 레이저 시스템, 모든 구성 요소	포함 Andor Technology - Quorum Technologies, Inc.를 통해 구매	2203-SYS
마이크로포인트 레이저 쿠르마린 염료(435nm)	Andor Technology	MP-27-435-DYE