脂肪酸组分和含量微藻分析
Summary
一种用于脂肪酸含量和组成在微藻基于机械破碎细胞，溶剂为基础的脂质提取，酯交换，以及量化和鉴定用气相色谱法的脂肪酸的测定方法进行说明。一个tripentadecanoin内标是用来弥补提取和不完整的酯交换过程中可能发生的损失。
Abstract
的方法，以确定存在于微藻总脂肪酸含量和组成进行说明。脂肪酸是微藻生物质的主要成分。这些脂肪酸可以存在于不同的酰基脂质类。尤其是存在于三酰基甘油（TAG）的脂肪酸是具有商业价值的，因为它们可以用于生产运输燃料，散装化学品，营养品（ω-3脂肪酸）和粮食商品。开发商业应用，都需要脂肪酸含量及组成可靠的定量分析方法。微藻是单细胞通过刚性的细胞壁所包围。 A脂肪酸分析方法应提供足够的细胞破碎解放所有酰基脂质和使用的提取方法应该能够提取所有酰基脂质类。
该方法这里给出存在于微藻所有脂肪酸可以准确和可重复的iDENtified并使用独立于它们的链长，不饱和度，或脂质类它们的一部分少量样品（5毫克）进行定量。
这种方法不提供有关不同脂质类的相对丰度的信息，但可以延伸到彼此分离的脂质类。
该方法是基于机械破碎细胞，溶剂为基础的脂质提取，脂肪酸对脂肪酸甲基酯（脂肪酸甲酯）酯交换反应，并定量分析和鉴定的气相色谱（GC-FID），脂肪酸甲酯的序列。一个TAG内标（tripentadecanoin）加入该分析方法之前，以纠正提取和不完整的酯交换反应过程中的损失。
Introduction
脂肪酸是一体微藻生物质的主要成分，通常弥补之间的细胞干重1-3 5-50％。它们主要存在于甘油脂的形式。这些甘油脂又主要包括磷脂，糖脂和甘油三酯（TAG）的。尤其是存在于TAG的脂肪酸是具有商业价值的，因为它们可以被用作用于生产运输燃料，散装化学品，营养品（ω-3脂肪酸）和粮食商品3-6的资源。微藻可以在海的水基种植介质成长，可以具有高得多的单位面积生产率比陆生植物，并在该不适合于农业的位置可以培养在光生物反应器，甚至可能是近海。由于这些原因，微藻通常被认为是一个很有前途的替代陆地植物生产生物柴油等大宗产品3-6。可能没有农业的升和或淡水（当在封闭的光生物反应器或栽培时，海洋微藻的使用）是需要他们的生产。因此，从微藻生物燃料衍生的被认为是第三代生物燃料。
脂肪酸（干重％），脂质类组合物，以及所述脂肪酸长度和饱和度的总细胞含量的微藻物种之间是高度可变的。此外，这些特性随培养条件如营养物可用性，温度，pH值和光强1,2。例如，当暴露在氮饥饿，微藻可积累大量的TAG。在最佳生长条件TAG典型构成的干重计少于2％，但是当暴露在氮饥饿TAG含量可提高到微藻干重的1到40％。
微藻主要生产脂肪酸与16和18的链长个碳原子，但是有些种类可以使长度最多为24个碳原子的脂肪酸。既饱和以及高度不饱和脂肪酸是由微藻生产。后者包括脂肪酸与营养益处（ω-3脂肪酸），如C20：5（二十碳五烯酸，EPA）和C22：6（二十二碳六烯酸; DHA）的量没有蔬菜的替代品存在1,2,4,7。脂肪酸链的长度和饱和度的（分布）也决定了藻类衍生的生物燃料和食用油4,8的性能和质量。
开发的微藻衍生的脂肪酸的商业应用中，都需要的脂肪酸含量和组成可靠的定量分析方法。
由于还指出Ryckebosch 等。9，在微藻脂肪酸分析，从其它底物（ 如植物油，食品，动物组织等）是区别于导致1）微藻是单细胞的刚性细胞壁所包围，复杂的脂质提取; 2）微藻含有各种脂质类和脂质类分布是高度可变的7。这些不同的类脂质有各种各样的化学结构和如极性性质。另外，不是酰基脂质其它脂质类生产; 3）微藻含有多种脂肪酸，范围从在长度12-24个碳原子，同时含有饱和以及高度不饱和脂肪酸。因此，开发了以分析脂肪酸底物比微藻其它方法，可能不适合于分析脂肪酸的微藻。
如由Ryckebosch 等 9评论，常用的脂质提取程序之间的主要区别是在所使用的溶剂系统。由于种类繁多目前在微藻的脂质类的，在每个极性不同，提取的脂的数量将与使用10-12溶剂不同而不同。这导致脂质含量和组成在文学9,10介绍的不一致。根据所用的溶剂系统中，基于溶剂萃取而不破碎细胞的方法通过，例如，珠击或超声处理，可能无法提取，因为一些微藻物种9,13的刚性结构的所有脂质。在不完全的脂质提取的情况下，不同的类脂质的提取效率可以变化14。这也可对测得的脂肪酸组合物的效果，因为脂肪酸的组成是可变的脂质类7之间。
我们的方法是基于机械破碎细胞，溶剂为基础的脂质提取，脂肪酸对脂肪酸甲基酯（脂肪酸甲酯）酯交换反应，并且量化和识别使用气相色谱与火焰电离组合脂肪酸甲酯组成的序列化检测器（GC-FID）。在三酰基甘油（tripentadecanoin）形式的内标是在分析过程之前加入。提取和不完整的酯交换过程中可能发生的损失可以被用于纠正。该方法可用于确定内容以及存在于微藻生物质的脂肪酸的组合物。存在于不同的酰基脂质类，包括存储（TAG）以及膜脂（糖脂，磷脂），被检测，识别和准确和再现地量化由该方法仅使用少量样品（5毫克）的所有脂肪酸。此方法不提供有关不同类脂质的相对丰度信息。然而，该方法可以扩展到从对方1分离脂质类。不同的类脂质的浓度和脂肪酸组成可以被单独确定。
在文献中其他几个方法描述分析脂质微藻。一些方法集中在总亲脂性成分15，而其他方法集中在总脂肪酸9,16。这些替代品包括重量法测定总提取脂质，直接转酯化脂肪酸的利用色谱法结合定量和染色细胞与亲脂性荧光染料。
常用的替代品的使用色谱脂肪酸的量化是用重量法测定17,18脂质定量。的测定重量法优点是缺乏像气相色谱仪的先进和昂贵的设备要求;缓解设定的，因为标准化的分析设备（ 如索氏）的可用性起来的程序，以及一个重量法测定是耗时少比色谱法为基础的方法。使用基于色谱方法对超视距的主要优点呃手的是，在这种方法中仅脂肪酸计量。在一个重量法测定含脂类，如色素或类固醇的非脂肪酸，也包括在确定。这些含非脂肪酸的脂质可以弥补脂类总量的很大比例（> 50％）。如果一个人只关心脂肪酸含量（例如，用于生物柴油的应用程序），它会在一个重量法测定是用来被高估。另外，在重量分析确定用来衡量所提取的脂类分析天平的准确度判断为需要将所使用的样本大小。这个量通常比当色谱使用所需的量多。最后，使用色谱法重量分析测定的另一个优点是，色谱提供了有关的脂肪酸组合物的信息。
另一种方法给我们提出的方法是直接酯交换16,19,20。在该方法中脂质提取和脂肪酸的酯交换反应，以脂肪酸甲酯相结合，在一个步骤。这种方法比单独的提取和酯交换步骤更快，但结合这些步骤限制了可用于萃取的溶剂。这可能提取效率产生负面影响。一个单独的脂质提取和酯基转移步骤的另一个优点是，它允许对这些步骤1之间的额外的脂质类分离。这是不可能的，当直接酯交换使用。
其他常用的方法来确定在微藻的脂质含量，包括染色与亲脂性荧光染料，如尼罗河生物质能红色或肾上腺素和测量荧光信号21,22。这些方法的优点在于，它们比其它方法少费力。这些方法的缺点是，所述荧光响应是，由于各种原因，可变SPECI之间ES，栽培条件下，脂质类和分析程序。作为一个例子，一些这些变化是由在染料的吸收差异由微藻引起的。因此使用另一种定量分析方法的校准是必要的，优选为所有不同的培养条件和生长阶段进行。最后，这个方法不提供有关的脂肪酸组成的信息，并且是不准确的和可重现的比基于层析方法。
该方法是基于由拉默斯等 23和Santos 等 24记载的方法，也被通过各种其他作者1,25-27应用。还有其他方法可用，基于相同的原理，并可能提供类似的结果9,28。
Protocol
Representative Results
Discussion
所描述的方法可以用于确定内容以及存在于微藻生物质的总脂肪酸的组成。从所有脂质类，包括存储（TAG）以及膜脂质（磷脂和糖脂）衍生的脂肪酸，被检测到。所有脂肪酸的链长的饱和的和度存在于微藻可以被检测和分辨。该方法是基于机械破碎细胞，溶剂为基础的脂质提取，脂肪酸对脂肪酸甲酯的酯交换，并用气相色谱与火焰离子化检测器（GC-FID）组合脂肪酸甲酯的定量。该方法需要少量的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作的一部分是由财政研究所的创新促进了科学和技术战略基础研究（IWT-SBO）项目阳光和BIOSOLAR细胞的支持。埃里克更大胆和BackKim阮都承认他们对珠跳动过程的优化贡献。
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
References
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
- Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
- Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
- Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
- Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 89 (2), 189-198 (2011).
- Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
- Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
- Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
- Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, 75-77 (2010).
- Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
- Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
- Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
- Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
- Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
- Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing “green oil” in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
- Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
- Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
- Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
- Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
- Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
- Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
