앞으로 유전 접근<em> 클라미디아의 trachomatis</em
Summary
우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다.
Abstract
클라미디아의 trachomatis, 성병 및 안구 감염의 병인 에이전트, 재조합 DNA와 가난 때문에 실험 변환에 해당 다루기 힘듦을 특징으로 남아있다. 우리는 C에서 유전자 분석을 수행 할 수있는 방법을 개발 분자 유전 학적 도구의 부족에도 불구의 trachomatis. 우리의 방법이 포함됩니다 : I)를 빠르게 별개의 표현형과 유전 정의 된 돌연변이의 포괄적 인 라이브러리를 생성하는 화학 돌연변이, ii)에서 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)가 기본 유전 병변을지도하고 변이 유전자 (들) 사이의 연결을 발견하고.. 일반적인 표현형;. 돌연변이 야생형 박테리아와 포유 동물 세포의 공동 감염을 통해 재조합 균주의 III는) 생성. 따라서, 우리는 유전자형과 표현형 사이의 인과 관계를 확립 할 수 있었다. 화학적으로 유도 된 유전자 변이와 WGS의 결합은 상호 유전자형 – 표현형 협회에게 우리말을 설정하려면LD는 유전자 분석에 현재 어려운 의학 및 환경 중요한 미생물의 큰 목록에 광범위하게 적용합니다.
Introduction
관련과 미국에서 연간 약 280 만 생식기 감염 (질병 통제 센터) 후유증과 같은 골반 염증성 질환, 자궁외 임신, 불임 (1)에 대한 의무 세포 내 세균 클라미디아의 trachomatis 계정. 클라미디아 균은 고유 한이 전염성하지만 비 복제 초등학교 바디 (EB) 및 비 감염성하지만, 증식하는 그물 몸 (RB) : 두 가지 형태로 구성된 이상성 개발주기 생리학. 감염 endoctyotosis (2) 다음 상피 세포에 사채의 첨부 파일이 시작됩니다. 막 바인딩 공포는 포함을라고 이내에 교환 사채는 이진 핵분열에 의해 복제 RB 형태로 분화. 중반 사이클에서, RBS 전환 당시 감염의 새로운 라운드를 시작하기 위해 세포 공간으로 추방 사채,에 때 숙주 세포 lyses (3).
C. trachomatis에 있습니다이러한 세균 유전학 대부분의 연구 중심되었습니다 타겟 유전자 교체, 트랜스포존과 transducing에 파지, 표준 분자 유전 학적 도구와 일상적인 조작에 내화물, 그것은 개인의 클라미디아 유전자가 타고난 면역 회피에 기여하는 정도 불분명하다 , 영양소 수집, 개발 전환, 또는 진핵 호스트 (4) 내 병원체의 생존에 중요한 다른 프로세스. 따라서이 병원체는 임상 적 중요성에도 불구하고 저조한 특징 남아있다.
클라미디아 균의 게놈. 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 염기 서열 여러 종 biovars와 (5) (~ 1MB의) 상대적으로 작은 수 있습니다. WGS하여 비교 게놈 분석은 독성 요인의 잠재적 기능 (9, 10)에 관해서 몇 가지 정보를 제공하고 있습니다 클라미디아 종과 인간 (6-8)에 어느 정도에 그들의 적응의 진화에 독특한 통찰력을 제공하고 있습니다. 티임상 분리하여 표시 그는 유전 적 다양성은 유전자의 돌연변이가 쉽게에 대한 선택했을 아마도 때문에, 체계적으로 대부분의 독성 요소의 기능을 매핑하는 데 필요한 해상도를 제공하지 않습니다. 독성의 측정 결함, 조사 할 수있는 돌연변이의 스펙트럼을 확장 할 수있는 정의 된 분석과 함께 자연 선택, 돌연변이 유발 유전자 변이의 혼란 함을 주죠 효과없이. 화학 돌연변이는 특히 그들이 널, 조건, hypomorphic (감소 함수)를 생성 할 수 있습니다으로 유용하고, hypermorphic (함수의 이득) 대립 유전자이다. 강력한 차세대 게놈 시퀀싱 기술의 도착과 함께, 이러한 돌연변이 쉽게 식별 매핑 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 강한 협회는 앞으로 유전자 접근 방식의 적용을 가능하게하는 유전자 또는 유전 경로의 변이와 일반적인 표현형 사이에 만들 수 있습니다.
임상 균주의 게놈 시퀀스 모자이 B 밝혀etween의 혈청 형과 자주 재조합 (11)의 궤적. 재조합 경험적 증거는 두 계통에서 유전 적 기여 (12, 13)을 가지고 계시 이중 저항 재조합 자손의 두 가지 항생제 내성과 선택의 공동 감염을 통해 증명되었다. 따라서, 공동 감염 설정 야생형과 돌연변이 균주 간의 유전 적 교환은 화학적으로 유도 된 돌연변이의 분리가 관찰 된 표현형에 이르게 영향을받는 유전자를 찾아 낼 수 있습니다.
여기에서 우리는 화학 돌연변이, WGS, 감염된 세포 내에서 DNA 교환 (14) (그림 1)에 대한 시스템을 기반으로 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 유전자형과 표현형 사이의 연계를 설정으로이 방법은 유전자 분석을위한 기본 요구 사항을 충족합니다. 중요한 것은,이 재조합 DNA의 변화와 종종 비 모델 미생물의 유전자 기능의 분석 속도 제한 단계는 박테리아 유전자의 insertional 비활성화에 대한 기존의 분자 도구의 도움없이 달성된다.
하나의 중요한 단계는 패 정제 된 돌연변이 체의 클론을 보장하는 것입니다. 야생…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Ethyl methanesulfonate (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid) | |||
| SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid) | |||
| Water (sterile, tissue culture grade) | |||
| 2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate | Sigma | D7777 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1.2% GTG Agarose , autoclaved | Lonzo | 50070 | |
| Genomic DNA purification kits | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Ethanol (molecular biology grade) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer | |||
| 25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks) | |||
| 6-well tissue culture plates | |||
| 12-well tissue culture plates | |||
| 96-well tissue culture plates | |||
| Chemical safety hood | |||
| Biological safety hood | |||
| >Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates | |||
| >Dissection microscope | |||
| Fluorometer (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
References
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