Forward Genetiske tilnærminger i<em> Chlamydia trachomatis</em

Summary

Vi beskriver en metode for å utføre genetiske analyser i Chlamydia basert på kjemisk mutagenese og hele genom sekvensering. I tillegg, er et system for utveksling DNA innenfor infiserte celler er beskrevet som kan anvendes for genetisk kartlegging. Denne metoden kan være bredt anvendelig på mikrobielle systemer mangler transformasjon systemer og molekylære genetiske verktøy.

Abstract

Chlamydia trachomatis, den agens for seksuelt overførbare sykdommer og okulære infeksjoner, forblir dårlig karakterisert grunn av sin intractability til eksperimentell transformasjon med rekombinant DNA. Vi utviklet en tilnærming til å utføre genetiske analyser i C. trachomatis tross for mangel på molekylærgenetiske verktøy. Vår metode innebærer: i) kjemisk mutagenese å raskt generere omfattende biblioteker av genetisk definerte mutanter med forskjellige fenotyper, ii) hel-genom sekvensering (WGS) å kartlegge de underliggende genetiske lesjoner og for å finne sammenhenger mellom muterte genet (e) og.. en felles fenotype;. iii) generering av rekombinante stammer gjennom co-infeksjon i celler hos pattedyr med mutant og villtype bakterier. Følgelig kunne vi etablere årsakssammenhenger mellom genotyper og fenotyper. Koblingen av kjemikalieutløst genet variasjon og WGS å etablere korrelative genotype-fenotype assosiasjoner Should være bredt aktuelt for stor liste over medisinsk og miljømessig viktige mikroorganismer i dag vanskelige å genetisk analyse.

Introduction

De obligate intracellulære bakterien Chlamydia trachomatis står for anslagsvis 2,8 millioner genitale infeksjoner per år i USA (Center for Disease Control) med tilhørende følgetilstander som bekkeninfeksjon, ektopisk svangerskap og infertilitet (1). Chlamydia spp. har en unik fysiologi med en bifasisk utviklingsmessig syklus bestående av to former: den smittsomme men ikke-replikerende elementær hoveddel (EB) og infeksiøs men replikative reticulate legeme (RB). Infeksjon begynner med å feste en EBS til epitelceller etterfulgt av endoctyotosis (2). Innenfor en membran-bundet vakuole kalles en inkludering, EBS differensiere inn i RB form, som deretter gjentak av binær fisjon. Midt i syklusen, RBS overganger tilbake til EBS, som deretter utvist i det ekstracellulære plass til å sette i gang nye runder med infeksjon når verten celle løser opp (3).

C. trachomatis erildfast til rutine manipulasjon med standard molekylærgenetiske verktøy, for eksempel målrettet genet erstatning, transposoner, og transducing phages, som har stått sentralt i de fleste studier i bakterielle genetikk, er det uklart i hvilken grad individuelle Chlamydia gener bidrar til unndragelse av medfødt immunitet , nærings oppkjøpet, utviklingsmessige overganger eller andre prosesser som er viktige for patogen overlevelse innenfor en eukaryote vert (4). Derfor forblir dette patogenet dårlig karakterisert tross for sin kliniske betydning.

Genomet hos Chlamydia SPP. er relativt liten (~ 1 Mb) (5) med flere arter og biovars sekvensert ved hjelp av neste generasjons sekvensering teknologier. Komparativ genom analyse av WGS har gitt unik innsikt i utviklingen av chlamydia-arter og deres tilpasning til mennesker (6-8) og til en viss grad har gitt noen opplysninger om den potensielle funksjon av virulens faktorer (9, 10). THan genetisk mangfold vises av kliniske isolater gir ikke den oppløsningen som kreves for å systematisk kartlegge funksjonen til de fleste virulens faktorer, antagelig fordi mutasjoner i slike gener ville ha vært lett valgt mot. Uten konfunderende effekter av naturlig utvalg, mutagene-indusert genet variasjon, kombinert med definerte analyser som måler feil i virulens, kan utvide spekteret av mutasjoner som kan kartlagt. Kjemiske mutagener, i særdeleshet, er anvendbare som de kan generere null, betinget, hypomorphic (redusert funksjon), og hypermorphic (gevinst funksjon) alleler. Med ankomsten av robuste neste generasjons genom-sekvensering teknologi, kan slike mutasjoner kan lett identifiseres og kartlegges. På denne måte kan sterke assosiasjoner foretas mellom mutasjoner i et gen eller genetisk vei og en felles fenotype, det mulig å anvende frem genetiske tilnærminger.

De genomsekvenser av kliniske stammer avslørt mosaicism between serovarer og loci av hyppige rekombinasjon (11). Empirisk bevis for rekombinasjon ble demonstrert ved koinfeksjon av to forskjellige antibiotika resistente stammer og valg av den doble motstandsdyktig rekombinant avkom, som ble avdekket for å ha genetiske bidrag fra begge stammer (12, 13). Dermed kan genetisk utveksling mellom villtype og mutant stammer i en co-infeksjon innstilling segregering av kjemisk-indusert mutasjoner for å finne den berørte genet som fører til den observerte fenotype.

Her beskriver en metode for å utføre genetisk analyse på Chlamydia basert på kjemisk mutagenese, WGS og et system for utveksling DNA innenfor infiserte celler (14) (figur 1).

Protocol

En. Kjemisk Mutagenese Merk: Vi fant at replicative RB form er mer mottagelig for kjemisk mutagenese enn EB skjemaet. Midt i syklusen (mellom 18. til 20. HPI), RBS er på de største tallene før RB-EB overgang. Fordi Chlamydia trachomatis er en obligat intracellulær patogen, kan virkningene av mutagen på vertens helse begrense bakteriell utvinning. Vero-celler ble funnet å være mer resistente overfor de negative virkningene av høye nivåer av EMS enn andre cellelinjene som ble t…

Representative Results

Eksponering for mutagen fører til inneslutninger som vises blottet for bakterier, antagelig på grunn av bakteriell celledød. Vanligvis vil serovar LGV-L2 helt lyse infiserte celler i løpet av 48 timer etter infeksjonen, men behandling med mutagener kan utvide denne syklusen til> 90 timer. Omtrent 10% av inneslutninger er forventet å komme seg. I våre forsøk, infiserte Vero-celler ble behandlet med 20 mg / ml EMS førte til en 99% reduksjon i utvinningen av smittsomme avkom sammenlignet med ubehandlede kontroll…

Discussion

Denne metodikken oppfyller grunnleggende krav til genetisk analyse som det etablerer sammenhengen mellom genotyper og fenotyper. Viktigere, hvilket oppnås uten hjelp av konvensjonelle molekylære verktøy for rekombinant DNA-transformasjon og innsettingen inaktivering av gener i bakterier, som ofte er et hastighetsbegrensende trinn i analysen av gen-funksjon i ikke-modell mikrober.

Et kritisk trinn for å sikre klonalitet av plaque-rensede mutanter. Krysskontaminering med vill type eller &q…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS)	Sigma	M0880
Cyclohexamide	Sigma	C4859-1ML
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)	Life Technologies	14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate	Sigma	D7777
Nonessential amino acids (NEAA)	Life Technologies	11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved	Lonzo	50070
Genomic DNA purification kits	Qiagen	69504
DNAzol	Life Technologies	10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit)	Invitrogen	Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument	Covaris