Method Article

앞으로 유전 접근 클라미디아의 trachomatis

DOI:

10.3791/50636

⸱

October 23rd, 2013

 , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for Microbial Pathogenesis, Duke University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다.

Abstract

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클라미디아의 trachomatis, 성병 및 안구 감염의 병인 에이전트, 재조합 DNA와 가난 때문에 실험 변환에 해당 다루기 힘듦을 특징으로 남아있다. 우리는 C에서 유전자 분석을 수행 할 수있는 방법을 개발 분자 유전 학적 도구의 부족에도 불구의 trachomatis. 우리의 방법이 포함됩니다 : I)를 빠르게 별개의 표현형과 유전 정의 된 돌연변이의 포괄적 인 라이브러리를 생성하는 화학 돌연변이, ii)에서 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)가 기본 유전 병변을지도하고 변이 유전자 (들) 사이의 연결을 발견하고.. 일반적인 표현형;. 돌연변이 야생형 박테리아와 포유 동물 세포의 공동 감염을 통해 재조합 균주의 III는) 생성. 따라서, 우리는 유전자형과 표현형 사이의 인과 관계를 확립 할 수 있었다. 화학적으로 유도 된 유전자 변이와 WGS의 결합은 상호 유전자형 - 표현형 협회에게 우리말을 설정하려면LD는 유전자 분석에 현재 어려운 의학 및 환경 중요한 미생물의 큰 목록에 광범위하게 적용합니다.

Introduction

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관련과 미국에서 연간 약 280 만 생식기 감염 (질병 통제 센터) 후유증과 같은 골반 염증성 질환, 자궁외 임신, 불임 (1)에 대한 의무 세포 내 세균 클라미디아의 trachomatis 계정. 클라미디아 균은 고유 한이 전염성하지만 비 복제 초등학교 바디 (EB) 및 비 감염성하지만, 증식하는 그물 몸 (RB) : 두 가지 형태로 구성된 이상성 개발주기 생리학. 감염 endoctyotosis (2) 다음 상피 세포에 사채의 첨부 파일이 시작됩니다. 막 바인딩 공포는 포함을라고 이내에 교환 사채는 이진 핵분열에 의해 복제 RB 형태로 분화. 중반 사이클에서, RBS 전환 당시 감염의 새로운 라운드를 시작하기 위해 세포 공간으로 추방 사채,에 때 숙주 세포 lyses (3).

C. trachomatis에 있습니다이러한 세균 유전학 대부분의 연구 중심되었습니다 타겟 유전자 교체, 트랜스포존과 transducing에 파지, 표준 분자 유전 학적 도구와 일상적인 조작에 내화물, 그것은 개인의 클라미디아 유전자가 타고난 면역 회피에 기여하는 정도 불분명하다 , 영양소 수집, 개발 전환, 또는 진핵 호스트 (4) 내 병원체의 생존에 중요한 다른 프로세스. 따라서이 병원체는 임상 적 중요성에도 불구하고....

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Protocol

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1. 화학적 돌연변이 유발

참고 : 우리는 증식하는의 RB 양식 EB 양식보다 화학적 돌연변이 유발에 더 순종 것으로 나타났습니다. 중간 사이클 (HPI 20-18 사이)에서 RBS는 사전 RB-EB 전환에 가장 큰 숫자에 있습니다. 클라미디아의 trachomatis는 의무 세포 내 병원체이기 때문에, 호스트 건강에 돌연변이의 효과는 세균의 회복을 제한 할 수 있습니다. 베로 세포는 테스트를 다른 세포 라인보다 EMS 높은 수준의 부작용에 ​​저항 것으로 밝혀졌다.

재조합에 의한 변이의 분리는 항생제 내성 유전자 재조합 자손에 대한 선택을해야합니다. 우리는 재조합 분석을 수행하고 isogenic 균주를 분리하는 능력 돌연변이를 생성하기위한 약물 내성 변종 (예를 들어, 리팜핀, 스펙 티노 마이신, 또는 트리 메토 프림) 사용하는 것이 좋습니다. 항생제 내성은 단계적으로 선택 과정 (15, 16)에 의해 생성되었다.

아니E : 클라미디아의 trachomatis (변형 L2 / 434/Bu / ATCC VR902B가) BSL2 병원체이다. 이러한 병원균을 처리하기위....

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Results

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돌연변이에 노출 세균 세포의 죽음으로 인해 아마도, 세균없는 표시 함유로 연결됩니다. 일반적으로 혈청 형 LGV-L2 완전히 48 시간 게시물 감염에서 감염 세포를 용해되지만, 돌연변이와 치료> 90 시간이 사이클을 확장 할 수 있습니다. 흠의 약 10 %를 회복 할 것으로 예상된다. 우리의 실험에서, 감염 베로 세포 치료 컨트롤에 비해 전염성 자손의 회복에 99 % 감소했다 20 MG / ML EMS로 처리. 돌연변이 처리는 작은 플라크 (SPQ) (그림 3)를 포함 변경된 형태학과 plaques의 출현했다. 다른 형태학은 세분화 clumpy, 또는 (그림 3) 모양의 벌집 표시 패 (가) 있습니다. 이러한 표현형은 호스트 환경에서 감염과 생존을 위해 필요한 과정에 결함이 반영 될 수 있습니다. 작은 플라크 (SPQ)의 돌연변이 형태 일반적으로 훨씬 적은 전염성 자손을 생산하고 2 ~ 3 주 소요될 수 있습니다mplify. reversions과 억제 돌연변이 .......

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Discussion

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이 유전자형과 표현형 사이의 연계를 설정으로이 방법은 유전자 분석을위한 기본 요구 사항을 충족합니다. 중요한 것은,이 재조합 DNA의 변화와 종종 비 모델 미생물의 유전자 기능의 분석 속도 제한 단계는 박테리아 유전자의 insertional 비활성화에 대한 기존의 분자 도구의 도움없이 달성된다.

하나의 중요한 단계는 패 정제 된 돌연변이 체의 클론을 보장하는 것입니다. 야생 유형 또는 "벤치"돌연변이와 교차 오염을 신속 얻은 결과되는 돌연변이 균주로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, 비 클론 샘플의 전체 게놈 시퀀싱에 의해 매핑 돌연변이는 모호한 결과를 초래할 수 있습니다. 많이 plaqued 우물에서 돌연변이를 분리하거나 서로 너무 가까이에 플라크를 연결은 피해야한다. 또한, 느린 성장 돌연변이를 들어, revertants는 상대적으로 높은 주파수에서 나올 수 있습니다. 우리는 원본 또는 낮은 통로 주식을 보존 좋습니다. REPL교차 오염 또는 revertants 경우 aq.......

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Disclosures

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공개 할 아무것도 없다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11995-073
소 태아 혈청 (FBS)Cellgro35-010-CV
에틸 메탄 설포 네이트 (EMS) SigmaM0880
CyclohexamideSigmaC4859-1ML
Gentamicin Life Technologies15750-060
인산염 완충 식염수 (PBS)Life Technologies14190-144
0.493mM MgCl2 및 0.901mM CaCl2>2/CaCl2)를 사용한Life Technologies14190-133
1 M NaOH
5x SPG 완충액(1.25 M 자당, 50mM 인산나트륨, 25mM 글루탐산)
SPG 완충액(0.25M 자당, 10mM 인산나트륨, 5mM 글루탐산)
물(멸균, 조직 배양 등급)
2x DMEM(분말로 준비, 7.4g/L 중탄산나트륨시그마D7777
비필수 아미노산(NEAA)으로 Life Technologies11140-050
1.2% GTG 아가로스, 오토클레이브Lonzo50070
게놈 DNA 정제 키트Qiagen69504
DNAzolLife Technologies10503-027
에탄올(분자생물학 등급)
8mM NaOH
0.1M HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1- piperazineethanesulfonic acid) 완충
25cm2 조직 배양 플라스크 (T25 플라스크)
6-웰 조직 배양 플레이트
12-웰 조직 배양 플레이트
96-웰 조직 배양 플레이트
화학적 안전 후드
생물학 안전 후드
>조직 플레이트
>해부 현미경
형광계(Qubit)InvitrogenQ32866
적응형 집속 음향 S220 기기Covaris
완충) 액 회전용 원심분리기 및 어댑터

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
  2. Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. ....

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Chlamydia trachomatisChemical MutagenesisWhole Genome SequencingGenotype Phenotype AssociationRecombinant StrainsPlaque AssayEMS MutagenesisVero CellsHypotonic LysisForward Genetic Screen

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