Method Article

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

DOI:

10.3791/50638

⸱

October 17th, 2013

 , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

많은 치료 응용 프로그램은 신체의 세포 장벽에 걸쳐 약물 사업자와 그들의화물의 안전하고 효율적인 전송을 필요로합니다. 이 문서는 위장 (GI) 상피 세포와 같은 세포 장벽에 걸쳐 약 nanocarriers (나노 결정)의 전송 속도와 메커니즘을 평가하기 위해 설립 방법의 적응을 설명합니다.

Abstract

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서브 마이크로 미터 캐리어 (nanocarriers, 나노 결정은) 용해도, 안정성, 순환 시간, 타겟팅 및 방출을 개선하여 약물의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 몸에있는 세포 장벽을 통과하면 개입이 필요한 조직에 혈액 순환 및 전송에 치료 나노 결정의 모두 구두 전달을위한 중요합니다. 인접 셀, 또는 (ii) 상기 세포 횡단의 세포체를 통해 전송 자료는 엔도 시토 시스에 의해 내장되어 경로,,, 분비를 연동 접속점의 일시적인 중단을 통해, (I) 세포층 경로 : 세포 장벽에 걸쳐 NC 전송에 의해 달성된다 반대의 세포 표면 (transyctosis)에서. 세포 장벽에 걸쳐 배달 운송에 관련된 세포 표면 마커에 특이 적으로 결합 대상 에이전트와 치료 또는 사업자의 결합에 의해 촉진 될 수있다. 여기, 우리는 WHI 모델 세포 장벽에 걸쳐 범위와 NC 수송 메커니즘을 측정하는 방법을 제공합니다채널은 트랜스 웰 인서트에있는 다공성 막에 성장 위장의 단층 (GI) 상피 세포로 구성되어 있습니다. 투과성 장벽의 형성은 transepithelial 전기 저항 (티이), 제어 물질 transepithelial 수송, 타이트 접합부의 면역 염색을 측정함으로써 확인된다. 예로서, ~ 200 nm의 중합체 나노 결정은 치료화물을 운반하고 세포 표면 행렬식을 표적으로하는 항체로 코팅되어있는, 사용된다. 항체 또는 치료화물은 방사성 동위 원소 추적에 125 I로 표시되고, 표시된 나노 결정은 시간의 변화 기간 동안 세포 단일 층에 다락방에 추가됩니다. 내부 챔버로 이송 세포 및 / 또는 연결된 나노 결정은 검출 될 수있다. 무료 125 I의 측정 성능이 저하 된 분수의 뺄셈을 할 수 있습니다. 세포층 경로는 위에서 설명한 장벽 매개 변수에 NC 전송으로 인한 잠재적 인 변경을 결정함으로써 평가된다. 세포 횡단 수송 난엔도 시토 시스와 transcytosis 경로를 조절하는 효과를 주소에 의해 결정들.

Introduction

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외부 환경과 내부 구획 사이의 게이트웨이 등 신체의 행위에 휴대 장벽. 이는 위장관 혈류 1-3의 외부 노출면을 분리하는 상피의 경우입니다. 세포 장벽은 혈액과 실질 및 조직과 장기의 세포 구성 요소 사이의 인터페이스를 나타낸다. 본문에 이러한 세포 장벽을 통과 할 수있는 능력이 치료 및 진단 요원의 효율적인 전달을 위해 매우 중요 하나 이는 등 혈액 폐 장벽, 혈액 - 뇌 장벽과 같은 혈관의 안쪽 내피 안감의 경우 개입이 필요한 순환 및 조직 / 기관에.

치료 또는 진단 요원의 전달을 향상시키기 위해, 이러한 화합물은 서브 마이크로 미터 nanocarriers (나노 결정)에로드 할 수 있습니다. 이러한 약물 전달 차량은 다양한 제형으로 할 수있다화학 물질 및 약물의 용해도, 보호, 약물 동력학, 릴리스 및 신진 대사 4,5을 최적화 구조. 나노 결정은 또한 치료 조치 2,6 필요한 신체의 영역에 접착을 촉진 또는 친 화성 (예, 항체 등, 펩티드 당, 앱 타머,) 잔기를 표적으로 작용 화 될 수있다. 세포 장벽의 표면에 발현 결정에 나노 결정의 대상으로하는 것은 더 2,6로 및 / 또는 이러....

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Protocol

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1. 없이 Transwell 삽입의 세포 단층 배양

  1. 멸균, 바이오 안전성 레벨 2 세포 배양 후드에서 0.8 mm 애완 동물은 집게로 (통계적 의미에 대해, 상태 당 4 우물) 24 - 웰 플레이트에 삽입 트랜스 웰 기공 놓습니다. 후드를 입력 모든 자료는 에탄올로 소독해야한다.

참고 : 필터의 기공 크기가 사용되는 NC의 평균 크기에 맞는 선택해야, 멤브레인을 가로 질러 수송 가능하도록. 또한, 통계적으로 유의 한 결과를 각각의 실험 조건은 동일한 실험을 반복 내의 넷 (웰)의 최소 및 세 독립적 인 실험의 최소 필요하다.

  1. 수조에서 37 ° C로 세포 배양 4.5 g / L 글루코오스, 15 % 소 태아 혈청, 1 % 스트렙토 펜 보충 된 DMEM 배지를 함유하는 매체와 열을 준비한다.
  2. 세포 매체와 장소에서 (된 Caco-2) 인간의 상피 세포 대장 선암을 희석/ cm 2 1.5 × 105 세포의 밀도로 트랜스 웰 인서트의 상부 (정점) 챔버 내로 세포 용액 200-400 μL. 세포 매체의 900 μL - 700 이하 (기저) 챔버를 입력합니다.
  3. 단계 1.3에 표시된 양을 사....

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Results

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대상으로 나노 결정의 transepithelial 전송을 공부하는 우리의 세포 모델의 검증으로, 그림 2는, 된 Caco-2 세포 단층이 합류 ~ 12 일째에 도달 1.5 × 10 5 세포 / ㎠의 밀도로 도금 일 18까지 단일 층의 무결성을 유지하고 있음을 보여줍니다 티이 (그림 2A)로 표시. 이 낮은 티이에서 가난한 꽉 접합 라벨 (17 Ω × 센티미터 2, 5 일에 비해 높은 티이 (390 Ω × 센티미터 2 일 14)와 단층에 occludin 양성 꽉 접합의 존재 (그림 2B)에 의해 확인되었다 ).

NC 요소에 방사성 라벨의 추적은 기저 측에 이송 처음 혀끝의 챔버에 추가 된 이러한 구성 요소의 총량 (NC 항체 또는화물을 대상으로), 자신의 휴대 관련된 부분, 그 부분을 결정한다. 이러한 값은 N.......

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Discussion

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상기 논의 된 방법을 사용하여 세포 장벽에 걸쳐 표적 나토 수송을 연구 셀 모델은 이러한 경우의 혈액으로 GI 루멘으로부터 수송을 평가 관련된 된 Caco-2 상피 세포, 제공된 예로서 확립 될 수있다 경구 용 약물 전달 시스템의. 트랜스 웰 인서트의 GI 상피 세포 단일 층의 배양은 세포 투과성 장벽의 형성을 확인하는 봉사자의 측정 꽉 접합의 형광 면역 염색을 가능하게했다. 그 후, 125로 타겟팅 및 치료제의 방사성 표지 나는 세포 단일 층에와 GI에 걸쳐 대상으로 나노 결정의 신속하고 민감한 정량을 제공했다. 마지막으로, 기계 론적 연구는 수송은 세포층의 경로 대 기공을 갖는 경로를 통해 발생하는지 여부를 평가하기 위해 세포 내 이입 억제제, 봉사자, 그리고 알부민 세포층의 누출 분석을 사용하여 적용 하였다.

유사한 모델을 구축하는 데 중요한 매개 변수 나연구중인 세포 장벽의 생리적 특성을 반영해야한다 세포 유형의 선택. 사람 또는 동물 유래의 다양한.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) RG, 그리고 건강 (그랜트 R01 - HL98416)의 국립 연구소와 미국 심장 협회 (American Heart Association, 그랜트 09BGIA2450014)가 SM에게 수여 자금의 친교에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Transwell,BD Falcon삽입 353095 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1xCellgro10-013-CM 
소 태아 혈청 (FBS)Cellgro35-015-CV 
펜 스트렙Gibco15140 
인간 상피 결장 직장 선암종 (Caco-2) 세포ATCCHTB-37TM 
125요오드Perkin ElmerNEZ033H002MC방사성 위험
인산염 버퍼 식염수 (PBS)Gibco14190-235 
소 혈청 알부민 (BSA)Equitech BioBAH-66 
파라포름알데히드(16%)Fisher Scientific15710 
마우스 면역글로불린 G (IgG)Jackson ImmunoResearch015-000-003 
인간 ICAM-1에 대한 마우스 단클론 항체 (anti-ICAM)Marlin 1987 
&알파;-갈락토시다아제, 생두에서 추출한시그마G8507-25UN 
FITC 라텍스 비드, 100nmPolysciences, Inc.17150년 
트리톤 X-100시그마234729-500ML 
트리클로로아세트산 (TCA)Fisher ScientificSA433-500 
Occludin 항체 (Y-12), 염소 다클론 항-인간Santa Cruz BiotechnologySc-27151 
모노단실카다베린 (MDC)시그마D4008 
필리핀시그마F9765 
5-(N-에틸-N-이소프로필) 아밀로라이드(EIPA)시그마A3085 
워트만닌시그마W1628 
감마 카운터Perkin ElmerWizard2 
볼트-옴 미터World Precision InstrumentsEVOM2 
TEER 전극World Precision InstrumentsSTX100전극은 다양한 웰 플레이트에 사용 가능
Dynamic Light Scattering (DLS)MalvernNano-ZS90 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
  2. Mrsny, R. J. Lessons from nature: "Pathogen-M....

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Drug Delivery SystemsCellular BarriersTranswell ModelTransepithelial Electrical ResistanceRadioisotope TracingEndocytosis InhibitionParacellular TransportTranscytosis PathwaysCaco 2 CellsNanocarrier Transport

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