중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진
Summary
성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.
Abstract
신경 줄기 세포 (NSCs의)는 자기 갱신과 뉴런과 교세포로 분화 할 수있다. NSCs의 이식은 척수 손상 (SCI) 후 손실 뉴런 및 아교를 대체 할 수 있고, 병변 위와 아래 척수 세그먼트를 재 연결하는 중계 기능을 형성 할 수있다. 신경 줄기 세포를 이식 이전 연구는 척수 병변 공동 내에 불완전 이식편 생존에 의해 제한되었다. 또한, 이식 세포의 생존, 분화, 및 프로세스 확장의 추적이 최적화되지 않았다. 마지막으로, 이전의 연구에서, 배양 된 쥐의 NSCs의는 일반적으로 운명이 특정 세포 형태로 구동되지 않는 한, 오히려 신경보다 부상 척수에 이식 할 때 교세포로 분화하는 것으로보고되었다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 심한 SCI의 사이트에 NSCs의 생존, 통합 및 차별화를 개선하기 위해 새로운 방법을 개발했다. NSCs의 갓 녹색 플로리다를 표현하는 안정적인 형질 전환 피셔 344 쥐 라인에서 배아 일 14 척수 (E14)에서 분리되었다uorescent 단백질 (GFP)과는 성장 인자를 함유 피브린 매트릭스에 삽입 하였다; 병변 캐비티 그라프 세포를 유지하고 세포 생존을 지원하는 것을 목표로 제형. 섬유소 / 성장 인자 칵테일 NSCs을함으로써 염증의 피크 기간을 피하고 2 주 흉부 레벨 3 (T3) 완전 척수 transections 후 이식되었다. 결과 이식은 완전히 병변 구멍을 채워 호스트 척추 현저하게 장거리 코드 및 아교로 축삭을 확장 모두 신경 세포로 분화. GFP를 표현하는 교양 인간 NSCs의의 이식은 유사한 연구 결과의 결과. 따라서, 방법은 신경 줄기 세포 이식, 생존과 생체 내 연구 결과의 분석을 향상시키기 위해 정의된다.
Introduction
척수 손상 (SCI)는 종종 손상뿐만 아니라의 interneurons 및 운동 신경의 분절 손실을 일으키는 원인이되는 뇌로부터 신호를 전달 백색질, 또한 중앙 회색 문제. SCI의 결과는 모터와 병변 아래 감각 기능 양자의 손실이다. 불행하게도, 성인 중추 신경계 (CNS)는 자발적으로 영구적 인 기능 적자 1의 결과로, 다시 생성되지 않습니다. 따라서, 부상 성인 척수 및 개선 모터, 감각 및 자율 신경 기능의 재건은 SCI 연구의 중요한 목표이다. 신경줄 기세포 (NSCs의)은 직접적으로 배아 또는 성인 CNS로부터 격리 여부 분실 뉴런 및 아교를 대체하는 강력한 후보 셀이다. 또한, 이러한 세포 병변 사이트 2,3 걸쳐 축삭 전도를 복원하는 신규 기능 릴레이를 형성 할 가능성이있다.
현재까지 해부학의 상세한 해설, electrophys은 없었다iological 심각한 SCI 후 이식 NSCs의로의 연결을 중계 형성의 행동 효과. 첫째, 이식 NSCs의 태아의 중추 신경계 조직을 큰 병변 구멍에 이식 할 때 제대로 생존이에 대한 몇 가지 이유가 있습니다. 이전 연구는 큰 빈 낭성 병변 충치에게 4,5를 떠나, 상당한 초기 세포 손실을 보여줍니다. 일부 연구에서는 이식 된 세포가 연속적으로 나누어 병변 캐비티에게 4,5를 작성하지만이 주 일의 지연 상황이 발생할 수 있습니다, 이후 병변 사이트의 충전이 완료 또는 일치하지 않을 것입니다. 둘째, 세포의 생존, 분화 / 성숙하고, 이식 NSCs의의 파생물에 사운드 데이터를 제공하는 효율적인 추적 시스템이 부족했다. 대부분의 초기 연구는 antegrade 및 이식 2,3에서 축삭 돌기를 추적하는 역행 라벨을 이용했다. 그러나 이러한 기술은 부분적으로 만 자주 unclearly 표시 축삭 이식 세포에서 발생하는 예측 및 추적 방법은 subjec 있습니다이식 된 세포 이상 염료 누출로 인한 유물에 t. 다른 그룹은 부상 쥐 척수 5,6에 인간 태아 NSCs의 이식 후 축삭 돌기에 라벨을 인간의 특정 신경 세포 마커를 사용했습니다. 그러나 이러한 연구에서, 이종 이식은 지속적으로 잘 생존하지 않았다. 최근 GFP 리포터 유전자의 바이러스 배달은 배양 NSCs의 7,8 레이블을 사용 하였다. 그러나, GFP의 표현은 종종 일치했고 7을 규제 할 수있다. 최근, 안정 리포터 유전자, GFP 또는 인간 태반 알칼리 포스 파타 아제를 발현하는 형질 전환 마우스 또는 공여 쥐의 사용이 극적 생체 9,11에서 이식 신경 줄기 세포 / 전구 세포의 추적을 개선했다. 셋째, 여러 연구는 손상이나 부상 성인 척추 오호의 환경에 이식 할 때 배아 또는 성인 하나 CNS에서 파생 된 체외에서 배양 한 쥐의 NSCs의 독점적 폐해 계통으로 분화을 나타냅니다이러한 신경줄 기세포는 로컬 환경은 줄기 세포의 운명을 지시 할 수 있다는 것을 나타내는, 뉴런 및 체외에서 신경교 모두로 분화 할 수 있다는 사실에도 불구하고 D 7,12,13. 또한, 배양 NSCs의, 성인 CNS에서 파생 특히이 생체 내 13 신경교 계통으로 분화하는 고유 defaulty에 속성을 가질 수있다.
때문에 위에서 언급 된 한계, 우리 그룹은 최근에 중상을 입은 성인 척수 배아 NSC 추적, 생존, 분화 / 성숙을 개선하기 위해 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 간단히 말해서, 우리는 생체 이식 14 후 GFP 발현을 지속 GFP 리포터 유전자를 발현하는 형질 전환 안정 피셔 344 쥐 inbreed 라인 시작했다. 다음에, 우리는 배아 일부터 14 피셔 344 척수 뉴런 및 아교 모두를 생성 할 수있는 잠재력을 유지 개발 단계를 갓 절연 NSCs의 사용. 마지막으로, 우리는 임베디드성장을 함유 피브린 매트릭스에 갓 NSCs의 분해는 세포를 유지하고 균등 그래프트 세포 생존, 분화 및 통합을 지원하는 것을 목표로, 큰 병변 공동 내에이를 분산 15-17 요인. 이식은 T3 완전 절개, 척수 손상 후 2 주간의 사이트에 배치했다. 이러한 이식 세포는 지속적으로 완전한 절개 사이트를 가득 긴 거리 18 세 이상 호스트 척수로 축삭 많은 수의 확장 풍부한 신경 세포로 분화. 유사한 결과 면역 결핍 쥐 18에 배양 된 신경 줄기 세포의 이식을 사용하여 수득 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
손상된 척수에있는 NSC 이식을위한 주요 장애물 중 하나는 병변 센터에서 생존율이다. 병변 사이트의 틈새 나 구멍은 잠재적으로 감소 시키거나 supraspinal 축삭 손상 아래 분리 된 척수 세그먼트 사이의 기능적 연결을 릴레이의 형성을 약화시킬 수 있습니다. 또한, 이식 NSCs의 가난한 생존 호스트 조직과의 통합에 영향을 미치고, 따라서 호스트 신경 세포와 이식 뉴런의 연결을 줄일 수 있습니다. 세…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 쥐 자원 연구 센터 감사, 미주리 대학, 컬럼비아, 미주리, GFP 쥐를 제공; 인간의 신경 줄기 세포를 제공하는 Neuralstem 사. 이 작품은 재향 군인회, NIH (NS09881), 캐나다의 척추 연구 기관, 크레이그 H. Neilsen 재단, 그리고 버나드와 앤 스피처 자선 신탁에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
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