ارتفاع القرار جبل بأكمله<em> في الموضع</em> التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة
Summary
أصبح الزرد، والأسماك الاستوائية الصغيرة، نموذجا محببا لدراسة وظيفة الجين خلال التنمية الفقاريات والمرض. التعبير الزماني والمكاني من الجينات المستهدفة يمكن تحديده من خلال<em> في الموقع</em> التهجين. لدينا تحسين بروتوكول يسمح للكشف عن انخفاض النصوص وفيرة مع إشارة الخلفية غير محددة منخفضة.
Abstract
تركز هذه المقالة على جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) من الأجنة الزرد في. التكنولوجيا WISH يسهل تقييم التعبير الجيني سواء من حيث توزيع الأنسجة والمرحلة التنموية. وصفت البروتوكولات لاستخدام رغبة الأجنة الزرد باستخدام العقاقير تحقيقات RNA المسمى مع digoxigenin. يتم إنشاؤها من خلال دمج تحقيقات النيوكليوتيدات digoxigenin المرتبطة من خلال نسخ في المختبر من القوالب الجينات التي تم المستنسخة والخطي. تتم إزالة chorions من الأجنة التي تحصد في مراحل نمو محددة قبل الحضانة مع تحقيقات محددة. بعد إجراء الغسيل لإزالة الزائدة التحقيق، يتم تحضين الأجنة مع الأجسام المضادة لمكافحة digoxigenin مترافق مع الفوسفاتيز القلوية. من خلال توظيف ركيزة مولد اللون لالفوسفاتيز القلوية، يمكن تقييم التعبير الجيني محددة. ويمكن تبعا لمستوى التعبير الجيني يتم الانتهاء من الإجراء بأكمله في غضون 2-3 أيام.
Introduction
برزت الزرد (دانيو rerio) كنموذج حيوان قوية لدراسة تطوير الفقاريات، والمرض، والسلوك، والمخدرات في فحص 1-3. ويمكن الحصول على الأجنة الزرد بأعداد كبيرة من معبر واحد. الإخصاب والتنمية يحدث الرحم السابقين والأجنة واضحة بصريا تتطور بسرعة. تحدث أحداث التنموية الهامة خلال أول 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF). وهذا يشمل ظهور الجهاز براعم وبدء تمايز خلوي. ويمكن تحقيق ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن البروتينات من خلال Microinjection من الأجنة مع العقاقير morpholino (MO) [أليغنوكليوتيد أو مرنا على التوالي في مرحلة خلية واحدة أو اثنتين (0.75 HPF).
رغبة الأجنة الزرد يسهل الدراسة للتعبير المكانية والزمانية لجينات معينة من الفائدة. تطبيق تقنية WISH بعد Microinjection من الأجنة مع مرنا أو MO إلى الإفراط في EXPRوفاق سطيف أو مستويات بروتين معين ضربة قاضية يكشف تنظيم الفرق من الجينات الأخرى.
التغيرات في أنماط التعبير الجيني يمكن ربط مع التغيرات المظهرية وتكشف عن وظيفة الجينات المستهدفة خلال توالد الأعضاء في وقت مبكر. منذ تحقيقات يمكن إعداد وتخزينها في وقت مبكر، ويمكن تطبيق هذه التقنية ISH للكشف عن أنماط التعبير الجيني لا يقل عن 20 جينات في وقت واحد باستخدام لوحات ستة جيدا والعرف سلال مصنوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بتطوير أساليب محسنة لتصور الحمض النووي الريبي مع ارتفاع القرار. الإجراءات في الموقع التهجين تتم باستخدام بسيطة سلال مصنوعة خصيصا مع قيعان مسامية (الشكل 1). تتم معالجة الأجنة باستخدام حلول ريبونوكلياز خالية في 6 لوحات جيدا في درجة حرارة الغرفة ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W., et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
