Haute Résolution Mont entier<em> In Situ</em> Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l'expression des gènes et la fonction
Summary
Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L'expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée par<em> In situ</em> Hybridation. Notre protocole amélioré permet la détection de faibles relevés de notes abondantes avec signal de fond non spécifique faible.
Abstract
Cet article se concentre sur l'ensemble du montage hybridation in situ (WISH) des embryons de poisson zèbre. La technologie WISH facilite l'évaluation d'expression de gènes à la fois en termes de distribution des tissus et le stade de développement. Les protocoles sont décrits pour l'utilisation des embryons de poisson zèbre WISH de l'aide d'ARN antisens sondes marquées à la digoxigénine. Les sondes sont générés par l'incorporation des nucléotides digoxigénine liés par transcription in vitro des modèles de gènes qui ont été clonés et linéarisé. Les chorions d'embryons récoltés à des stades de développement définis sont retirés avant l'incubation avec des sondes spécifiques. Selon un procédé de lavage pour éliminer la sonde en excès, les embryons sont mis à incuber avec un anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline. En utilisant un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, l'expression du gène spécifique peut être évaluée. En fonction du niveau de l'expression génique de toute la procédure peut être complété dans les 2-3 jours.
Introduction
Le poisson-zèbre (Danio rerio) a émergé comme un modèle animal puissant pour l'étude du développement des vertébrés, la maladie, le comportement et le dépistage dans la drogue 1-3. Embryons de poissons zèbres peuvent être obtenues dans un grand nombre d'un seul passage. Fertilisation et le développement survient ex utero et les embryons optiquement transparents se développent rapidement. Événements critiques du développement se produisent pendant les 48 premières heures après la fécondation (HPF). Cela comprend l'apparition de l'organe ébauches et l'ouverture d'cytodifférenciation. Démontables ou la sur-expression de protéines peuvent être atteints grâce à la micro-injection d'embryons avec antisens morpholino (MO) des oligonucléotides ou d'ARNm respectivement à l'étape une ou deux cellules (0,75 HPF).
Le souhait des embryons de poisson zèbre facilite l'étude de l'expression spatio-temporelle des gènes d'intérêt spécifiques. Application de la technique de micro-injection WISH suite d'embryons avec l'ARNm ou de MO à plus-express ou les niveaux de protéines spécifiques knockdown révèle régulation différentielle d'autres gènes.
Changements dans les modes d'expression des gènes peuvent être corrélées avec des changements phénotypiques et révèlent la fonction des gènes cibles au cours de l'organogenèse tôt. Depuis sondes peuvent être préparés et stockés à l'avance, la technique ISH peut être appliqué à révéler des modèles d'expression génique pendant au moins 20 gènes à la fois en utilisant des plaques de six puits et des paniers sur mesure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons mis au point des méthodes améliorées pour visualiser l'ARN avec une haute résolution. Le dans les procédures d'hybridation in situ sont réalisées en utilisant des paniers sur mesure simples à fond poreux (figure 1). Les embryons sont traités à l'aide des solutions sans RNase dans des plaques 6 puits à température ambiante dans des conditions stériles.
De séparer les embryons paniers sont fabriqués à partir de différen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
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