Hohe Auflösung Ganze Berge<em> In Situ</em> Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen
Summary
Der Zebrafisch, einem kleinen tropischen Fischen, hat sich zu einem beliebten Modell zum Studium der Genfunktion während Wirbeltiere Entwicklung und Krankheit. Die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen kann bestimmt werden durch<em> In situ</em> Hybridisierung. Unsere verbesserte Protokoll erlaubt den Nachweis von niedrigen reichlich Transkripte mit geringen unspezifischen Hintergrund Signal.
Abstract
Dieser Artikel konzentriert sich auf whole-mount in situ Hybridisierung (WISH) von Zebrafisch Embryonen. Der Wunsch-Technologie erleichtert die Beurteilung der Genexpression sowohl in Bezug auf Verteilung im Gewebe und Entwicklungsstadium. Protokolle sind für die Nutzung der Wunsch Zebrafischembryonen Verwendung von Antisense-RNA-Sonden mit Digoxigenin beschrieben. Die Sonden werden durch den Einbau von Digoxigenin-linked Nukleotide durch in vitro-Transkription von Gen-Vorlagen, die geklont wurden und linearisiert generiert. Die Chorions von Embryonen in bestimmten Entwicklungsstadien geerntet werden, bevor die Inkubation mit spezifischen Sonden entfernt. Nach einem Waschvorgang, überschüssige Sonde zu entfernen, werden Embryonen mit anti-Digoxigenin-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase inkubiert. Durch die Verwendung eines chromogenen Substrat für alkalische Phosphatase kann Genexpression zu beurteilen. Abhängig von der Höhe der Genexpression das gesamte Verfahren kann innerhalb 2-3 Tagen abgeschlossen sein.
Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) als leistungsfähige Tiermodell für die Untersuchung der Entwicklung von Wirbeltieren, Krankheiten, Verhalten entstanden, und in-Wirkstoff-Screening 1-3. Zebrafisch-Embryonen können in großer Zahl aus einer einzigen Kreuzung erreicht werden. Befruchtung und Entwicklung tritt ex utero und die optisch klar Embryonen schnell zu entwickeln. Critical Entwicklungsstörungen Ereignissen während der ersten 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf). Dazu gehören das Auftreten von Organprimordien und die Einleitung cytodifferentiation. Knockdown oder Überexpression von Proteinen durch die Mikroinjektion von Embryonen mit Antisense-Morpholino (MO) Oligonukleotiden oder mRNA, die jeweils an der einen oder zwei Zell-Stadium (0,75 HPF).
Der Wunsch Zebrafischembryonen erleichtert die Untersuchung der räumlich-zeitliche Expression spezifischer Gene von Interesse. Anwendung des Wunsches Technik nach Mikroinjektion von Embryonen mit mRNA oder MO über-express oder Knockdown spezifische Protein-Ebene zeigt differentielle Regulation anderer Gene.
Veränderungen in der Genexpression Muster können mit phänotypische Veränderungen korreliert werden und zeigen die Funktion der Zielgene während der frühen Organogenese. Seit Sonden hergestellt und gelagert werden im Voraus, können die ISH-Technik angewendet, um die Genexpression Muster für mindestens 20 Gene zeigen in einer Zeit mit Sechs-Well-Platten und maßgefertigt Körbe werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben Methoden entwickelt, um eine verbesserte RNA mit hoher Auflösung sichtbar zu machen. Die in-situ-Hybridisierung Verfahren werden mit einfachen maßgeschneiderte Körbe mit porösen Böden (Abbildung 1). Die Embryonen werden unter Verwendung RNase-freien Lösungen in 6-Well-Platten bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen.
Zu trennen Embryonen Körbe sind aus verschiedenen farbigen Eppendorf-Röhrchen gemacht. Körbe mit oder ohne Rand sind für eine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
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