उच्च संकल्प पूरा पर्वत<em> स्वस्थानी</emजीन एक्सप्रेशन और समारोह का अध्ययन करने के Zebrafish भ्रूण भीतर> संकरण
Summary
zebrafish, एक छोटे से उष्णकटिबंधीय मछली, हड्डीवाला विकास और बीमारी के दौरान जीन समारोह के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बन गया है. लक्ष्य जीन के अस्थायी और स्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया जा सकता है<em> बगल में</em> संकरण. हमारे सुधार प्रोटोकॉल कम गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत के साथ कम प्रचुर मात्रा में टेप का पता लगाने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
यह लेख zebrafish भ्रूण की स्वस्थानी संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट पर केंद्रित है. इच्छा प्रौद्योगिकी ऊतक वितरण और विकास मंच के मामले में दोनों जीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन की सुविधा. प्रोटोकॉल digoxigenin के साथ लेबल antisense शाही सेना जांच का उपयोग zebrafish भ्रूण की इच्छा के उपयोग के लिए वर्णित हैं. जांच क्लोन और linearized गया है कि जीन टेम्पलेट्स के इन विट्रो प्रतिलेखन में के माध्यम से digoxigenin से जुड़े न्यूक्लियोटाइड शामिल द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. परिभाषित विकास के चरणों में काटा भ्रूण की chorions विशिष्ट जांच के साथ ऊष्मायन से पहले हटा रहे हैं. अतिरिक्त जांच को दूर करने के लिए एक कपड़े धोने की प्रक्रिया के बाद भ्रूण alkaline फॉस्फेट के साथ संयुग्मित विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी के साथ incubated हैं. Alkaline फॉस्फेट के लिए एक वर्णजनक सब्सट्रेट काम करके, विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति का आकलन किया जा सकता है. जीन अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है कि इस पूरी प्रक्रिया में 2-3 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है.
Introduction
zebrafish (Danio rerio) हड्डीवाला विकास, रोग, व्यवहार के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल के रूप में उभरा है, और में दवा स्क्रीनिंग 1-3 की है. Zebrafish भ्रूण एक भी पार से बड़ी संख्या में प्राप्त किया जा सकता है. निषेचन और विकास पूर्व utero और ऑप्टिकली स्पष्ट भ्रूण तेजी से विकसित होता है. गंभीर विकासात्मक घटनाओं के पहले 48 घंटे के बाद निषेचन (HPF) के दौरान होते हैं. इस अंग primordia की उपस्थिति और cytodifferentiation की दीक्षा भी शामिल है. प्रोटीन की पछाड़ना या अधिक अभिव्यक्ति antisense morpholino (एमओ) oligonucleotides के साथ भ्रूण के microinjection के माध्यम से हासिल की या एक या दो सेल मंच (0.75 HPF) में क्रमशः mRNA किया जा सकता है.
Zebrafish भ्रूण की इच्छा हित के विशिष्ट जीन की spatio-अस्थायी अभिव्यक्ति के अध्ययन की सुविधा. इच्छा तकनीक के अनुप्रयोग पर-expr को mRNA या एमओ के साथ भ्रूण के microinjection का पालनईएसएस या पछाड़ना विशिष्ट प्रोटीन का स्तर अन्य जीनों के अंतर विनियमन का पता चलता है.
जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन प्ररूपी परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध और जल्दी जीवोत्पत्ति के दौरान लक्ष्य जीन के समारोह को प्रकट किया जा सकता है. जांच के लिए तैयार है और अग्रिम में संग्रहित किया जा सकता है, ISH तकनीक छह अच्छी तरह प्लेटें और कस्टम बनाया टोकरी का उपयोग कर एक बार में कम से कम 20 जीन के लिए जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रकट करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम उच्च संकल्प के साथ शाही सेना कल्पना करने के लिए उन्नत विधियों को विकसित किया है. सीटू संकरण प्रक्रियाओं में झरझरा पैंदा (चित्रा 1) के साथ सरल कस्टम निर्मित बास्केट प्रयोग किया जाता है. भ्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
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