高解像度全マウント<em>その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内>ハイブリダイゼーション
Summary
ゼブラフィッシュは、小さな熱帯魚は、脊椎動物の発生と疾患の間に遺伝子機能を研究するための人気のあるモデルとなっている。標的遺伝子の時間的および空間的な表現は次式で求めることができる<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション。我々の改良プロトコルは、低非特異的バックグラウンドシグナルの低豊富な転写物の検出を可能にする。
Abstract
この記事では、ゼブラフィッシュ胚のin situハイブリダイゼーション（WISH） で全体のマウントに焦点を当てています。 WISH技術は、組織分布及び発達段階の両面での遺伝子発現の評価を容易にする。プロトコルはジゴキシゲニンで標識されたアンチセンスRNAプローブを用いてゼブラフィッシュ胚のWISHの使用について記載されている。プローブは、クローン化し、線形化された遺伝子テンプレートのインビトロ転写を介してジゴキシゲニン-結合ヌクレオチドを組み込むことによって生成される。定義された発達段階で収穫された胚のchorionsは、特異的なプローブとのインキュベーションの前に削除されます。過剰のプローブを除去するための洗浄工程の後、胚は、アルカリホスファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートする。アルカリホスファターゼのための発色基質を用いることにより、特異的な遺伝子発現を評価することができる。遺伝子発現のレベルに応じて、全体の手順は、2〜3日以内に完了することができる。
Introduction
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） は脊椎動物の発生、病気、行動、そして1-3の薬物スクリーニングの研究のための強力な動物モデルとして登場しました。ゼブラフィッシュ胚を単交雑から大量に得ることができる。受精と開発は元子宮を発生し、光学的に透明な胚は急速に発展。重要な発達のイベントは最初の48時間後に受精（HPF）中に発生する。これは、臓器原基の外観と細胞分化の開始が含まれています。ノックダウンまたはタンパク質の過剰発現は、アンチセンスモルホリノ（MO）オリゴヌクレオチドを用いた胚のマイクロインジェクションによって達成又は1つ又は2つのセルステージ（113 HPF）でそれぞれmRNAをすることができる。
ゼブラフィッシュ胚のWISHは、関心のある特定の遺伝子の時空間表現の研究を促進する。オーバーexprとmRNAまたはMOと胚のマイクロインジェクション後にWISH技術の応用ESSまたはノックダウン特定のタンパク質レベルは、他の遺伝子の差動規制を明らかにする。
遺伝子発現パターンの変化は、表現型の変化と相関し、早期器官中に標的遺伝子の機能を明らかにすることができる。プローブを調製し、予め記憶することができるので、ISH技術は、6ウェルプレートとカスタムメイドのバスケットを使用して、一度に少なくとも20の遺伝子の遺伝子発現パターンを明らかにするために適用することができる。
Protocol
1。ゼブラフィッシュ胚のin situハイブリダイゼーションホールマウント胚の1.1準備必要な発達段階で胚を収集します。胚の段階については、キンメルら 5を参照してください。 鉗子（デュモン時計屋がない。5鉗子ません）を使用して手動でchorionsを削除します。 PBSに成っホルムアルデヒドの4％溶液（PFA…
Representative Results
バスケット50胚（遺伝子当たり/実験条件ごとに）その遺伝子の発現パターンは一つの実験で達成することができると共にプロトコルを使用する。ほとんどすべての胚は、特定の遺伝子のための同様の発現パターンを示す。 in situハイブリダイゼーション染色の代表例を図3-6に示されている。 センスおよびアンチセンスリボプローブPC5.1に対応す?…
Discussion
我々は、高分解能でRNAを可視化する改良された方法を開発しました。 in situハイブリダイゼーション手順における多孔底部（図1）単純なカスタムメイドのバスケットを用いて行われる。胚を無菌条件下で、室温で6ウェルプレート中のRNaseフリー溶液を用いて処理される。
分離する胚のバスケットは異なる色のエッペンドルフチューブから作…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
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Cite This Article
Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. J. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).